沙地葡萄茎痘相关病毒RT-LAMP检测方法研究

【作者】 范旭东； 董雅凤； 张尊平； 任芳；

【机构】 中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心；

【摘要】 沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）是葡萄皱木复合病（Rugose wood complex disease）的病原之一,根据其特性及基因组结构,把它归于新确立的凹陷病毒属（Foveavirus）。GRSPaV广泛分布于世界葡萄产区,研究者已对大量表现茎痘症状的葡萄样品进行了检测,表明其与沙地葡萄茎痘症状密切相关。另有研究表明,GRSPaV与"Syrah"葡萄衰退病以及‘Richter110’葡萄叶脉坏死症也有着显著的相关性。目前,检测GRSPaV的方法主要有指示植物法、酶联免疫吸附法（ELISA）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光PCR等方法。由于GRSPaV不能摩擦接种到草本寄主上,病毒粒子难以分离纯化,只能依靠在细菌中表达的外壳蛋白免疫兔子获得多克隆抗体,其抗体的ELISA检测效果受注射兔子的表达蛋白抗原性、纯度和注射量的影响,且灵敏度低于RT-PCR方法。RT-PCR方法具有快速、高效、灵敏的特点,已广泛运用于GRSPaV的检测,但需要专门的实验人员和仪器设备才能进行。实时荧光PCR法在PCR的基础上,实现了封闭式实时检测,具有较高的灵敏度,已运用于包括GRSPaV在内的多种葡萄病毒检测,但是该方法需要昂贵的实时荧光PCR仪,并要合成探针,不适于基层单位应用。本研究建立了一种用于沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevinerupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）的RT-LAMP检测方法。以GRSPaV的RdRp基因序列（GenBank登录号:GQ478314）为靶序列,设计了3组RT-LAMP引物,从中筛选出一组有效引物,并确定了其适宜的反应温度和反应时间。对RT-LAMP产物进行HhaI酶切,酶切片段与理论片段大小一致,从而证明了RT-LAMP产物的特异性。RT-LAMP方法能够检测出GRSPaV的RNA最大稀释倍数为10^-4,比先前建立的RT-PCR方法更灵敏。田间葡萄样品RT-LAMP检测结果与已知样品带毒情况相同,表明RT-LAMP检测GRSPaV具有较好的可靠性。在RT-LAMP反应产物中加入染料SYBR GreenI（×1 000）可直接观察反应结果。研究建立的GRSPaV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏、可视化等特点,尤其适合基层使用,具有良好的应用前景。更多还原