番石榴园宏基因组Fosmid文库构建及杀线活性克隆的筛选

【作者】 赵志祥； 张怀军； 严婉荣； 肖敏； 陈绵才；

【机构】 海南省农业科学院农业环境与植物保护研究所海南省植物病虫害防控重点实验室；

【摘要】 从海南乐东受象耳豆根结线虫严重侵染的番石榴园中,健康番石榴根围取土样,经总DNA提取、纯化、末端修复、连接、包装和转染等过程,构建宏基因组Fosmid表达文库。特征分析表明:该文库库容31008个克隆,平均插入片段36.5kb,空载率1.7%,随机性98.1%,包含超过1Gbp的微生物基因组信息,适合大规模的微生物功能基因筛选及其所编码的活性产物的挖掘与利用。为寻找杀线蛋白酶基因,以脱脂奶为底物,经平板上透明圈表型选择,从中筛选出21FA6、5BA8、5FA8、20AA2、60HA9、14BA10、83FA2、83HA8、178FA8等9个含蛋白酶的活性克隆。在杀线虫室内活性测定中,以象耳豆根结线虫为靶标,经功能驱动筛选,从上述克隆中筛选出具有杀线功能的蛋白酶基因活性Fosmid克隆21FA6。测定结果表明:发酵上清液处理线虫8h后,线虫的死亡率为100%。煮沸10min后,处理线虫,24h后的死亡率仅为0.1%。说明蛋白酶对线虫具有较强的触杀活性。对于该基因结构以及蛋白酶理化特性等还需后续更详细的研究。更多还原