脂肽类化合物bacillorin的遗传、结构及抑菌机制

【作者】 罗楚平； 刘永锋； 张杰； 吴荷芳； 刘邮洲； 聂亚锋； 陈志谊；

【机构】 江苏省农业科学院植物保护研究所； 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室；

【摘要】 生防枯草芽孢杆菌Bs-916对真菌病害具有很好的防治效果。采用转座子构建Bs-916突变体库,以水稻纹枯病菌作为指示菌,从8 500个突变株中筛选到3株拮抗性能下降的突变株。PCR验证了转座子插入到了突变株基因组DNA中。虽然突变株相对Bs-916的生长速度、生物量和最终活菌数没有显著差异;但培养液对水稻纹枯病菌毒力和溶血性能显著下降。HPLC分析表明Bs-916分泌的脂肽类抗生素与iturinA具有不同保留时间,在结构上存在差异。突变株M-1、M-2相对Bs-916未出现相应的峰,M-3缺少一个峰,说明转座子的插入导致突变株丧失了Bs-916合成该脂肽类抗生素能力。反向PCR克隆转座插入位点周边序列及测序结果表明转座突变的基因与编码脂肽类化合物合成和调控相关的Malonyl coenzymeA transacylase,lipopeptide synthetase B,Sensor histidine kinase蛋白基因具有高度同源性。将上述脂肽类化合物命名为bacillorin,相应的操纵子命名为Bac。通过基因步行克隆上述完整功能基因簇并进行生物信息学分析,发现Bac基因与目前已报道的相应基因存在低同源性区域。采用同源重组更换Bac操纵子启动子为组成性表达强启动子和插入失活Bac操纵子启动子,分别得到突变株BGG104和BGG105。BGG104上清液相对Bs-916上清液对几种病原真菌毒力,血红细胞的溶血能力都显著提高;而BGG105则显著降低。用6 mol/L盐酸沉淀Bs-916和突变株上清液,再用等量甲醇抽提制备脂肽类化合物。反相HPLC分析表明Bs-916产生的脂肽类化合物与iturinA具有不同保留时间,BGG104培养液中脂肽类化合物量增加了3倍,BGG105培养液中未检测到脂肽类化合物峰。运用电喷雾质谱法测得Bac操纵子合成的脂肽类化合物分子量分别为:1 007.7 Da、1 021.7 Da和1 035.7 Da;推测属于相差一个（—CH₂）亚甲基同系物。以常见的12种病原真菌作为供试菌,在室内进行了bacillorin抑菌活性的定性及定量分析。结果表明bacillorin对所有的供试真菌的菌丝生长均有抑制作用,但其对不同病原真菌的毒力存在显著差异。显微观察表明bacillorin处理过的菌丝异常生长,菌丝体内液泡增多,细胞膜渗透性发生变化,最终导致菌丝体破裂;bacillorin处理过的稻瘟病菌孢子萌发时间明显推迟,同时导致芽管膨大、致畸、破裂。Bacillorin能引起菌丝体细胞膜透性的变化,造成液体培养基电导率增加。Bacillorin对水稻稻苗瘟具有较好的防治效果。以上结果看出,bacillorin是属于iturin A家簇的新型脂肽类化合物,具有广谱高效的抗真菌活性,极具潜力开发为一种环境友好型的生物农药。更多还原