【作者】 杨迎青； 杨媚； 李明海； 李勇； 贺晓霞； 周而勋；

【Author】 YANG YingQing YANG Mei LI MingHai LI Yong HE XiaoXia ZHOU Erxun~* (Department of Plant Pathology South China Agricultural University Guangzhou 510642 China)

【机构】 华南农业大学植物病理学系；

【摘要】 水稻纹枯病是世界上重要的水稻病害之一,其病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani K(u|¨)hn),由于该病原菌的寄主范围非常广泛,因而在防治上非常困难。立枯丝核菌目前至少有14个融合群(anastomosis groups,AGs),水稻纹枯病菌属于AG-1群IA亚群。近年来,随着分子生物学向植物病理学的渗透和发展,真菌的遗传转化也越来越受到重视,因为转化是获得目的基因的一个简单方法。目前至少已有100种丝状真菌实现了遗传转化。真菌遗传转化的方法有多种,其中的根癌农杆菌介导的转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)是近年来发展起来的一种新方法,与其它方法相比,该方法具有操作简便、转化效率高和单拷贝率低等特点,因而成为真菌遗传转化和基因克隆的强有力工具。为了建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,本研究以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solaniAG-1 IA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时AS(acetosyringone,乙酰丁香酮)的浓度、共培养温度和共培养时ISM(induction solid medium,诱导固体培养基)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌(R.solani AG-1IA)进行ATMT的最优化系统。这个最优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8 h,共培养20 h,共培养时ISM的AS浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时ISM pH 5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出了500 bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性。结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730 bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明:T-DNA确实已经插入到目标菌株GD118中。更多还原