自噬在组胺H3受体拮抗剂对脑缺血的神经保护中的作用

【作者】 闫海静； 张翔南； 马婧； 范彦英； 张晨晖； 王融溶； 胡薇薇； 陈忠；

【机构】 浙江大学医学院神经生物学研究所药理学系； 浙江大学药学院； 浙江温州医学院生命科学学院医学遗传学系；

【摘要】 目的探讨组胺H3受体拮抗剂对小鼠局灶性脑缺血引起的神经损伤的保护作用及其机制。方法利用C57雄性成年野生型(WT)和组氨酸脱羧酶基因敲除(HDC-KO)小鼠,采用短暂性大脑中动脉梗阻(tMCAO模型,缺血1h后再灌)进行局灶性脑缺血损伤。离体实验采用大鼠皮层海马神经元缺氧缺糖(OGD)2 h再灌22 h模型。利用TUNEL染色检测凋亡细胞数量,利用MDC染色方法检测缺血后自噬泡产生情况,western blot检测凋亡关键蛋白cleaved-caspase 3的表达,免疫组织化学染色观察自噬关键蛋白LC3的表达。结果在整体模型上给予组胺H3受体拮抗剂thioperamide、clobenpropit后显著降低缺血再灌引起的脑梗死体积(与缺血组比较,给药组降低了60%,P<0.001),在HDC-KO小鼠上以及WT小鼠通过腹腔注射α-FMH抑制组胺合成后,thioperamide仍然具有神经保护作用。并且,缺血再灌后,缺血周边区凋亡细胞比例增加,cleaved-caspase 3的表达显著上调,给予thioperamide能显著抑制周边区神经细胞的凋亡(与缺血组比较,TUNEL阳性细胞比例降低了60%,P<0.001)和cleaved-caspase 3的表达(与缺血组比较,给药后下降了43%,P<0.01)。此外,给予thioperamide后可上调自噬关键蛋白LC3的表达,免疫组织化学染色结果显示,缺血再灌后,周边区LC3蛋白表达增加,给药后进一步促进自噬发生,表现为阳性LC3蛋白表达细胞个数增加,胞浆表达量也有显著上调。给予自噬抑制剂3-MA,可以逆转thioperamide的保护作用,表现为脑梗死体积显著增加(与单给thioperamide比,增加了177%,P<0.001),细胞凋亡明显增加(与单给thioperamide比,凋亡比例增加了63%,P<0.01);cleaved-caspase3蛋白表达也增加。在离体神经元OGD再灌模拟体内缺血再灌模型中,给予thioperamide后可提高细胞存活率(与OGD组比较,给药后存活率提高了33%,P<0.05)。MDC染色结果显示,缺血再灌诱导自噬泡产生,给予thioperamide进一步提高自噬泡的数量,包括发生自噬的细胞个数和单个细胞内自噬泡数量。TUNEL染色结果提示,OGD诱导凋亡细胞比例上调,给药予thioperamide后凋亡细胞减少,而给予自噬抑制剂3-MA则可逆转thioperamide的抗凋亡作用。结论组胺H3受体拮抗剂对缺血再灌引起的神经损伤具有保护作用,其保护机制可能不是通过增加脑内组胺水平,而是通过促进自噬的发生,降低细胞凋亡来发挥神经保护作用。更多还原