GDNF体外诱导中脑神经干细胞分化的实验研究

【作者】 丁继固； 丁文杰； 赵克勇；

【机构】 咸宁学院医学院解剖学教研究室；

【摘要】 目的探索GDNF在体外诱导小鼠胚胎中脑神经干细胞(M-NSCs)分化成多巴胺能神经元的培养方法,为M-NSCs移植治疗帕金森病(PD)提供实验依据。方法在有血清条件下体外培养鼠胚M-NSCs,予以GDNF作诱导分化。TH免疫细胞化学鉴定,流式细胞术检测TH阳性神经元的百分率。GDNF最初从大鼠胶质瘤细胞系B49的条件培养液中分离纯化得到的,对大鼠中脑多巴胺能神经元有特异性营养作用;对于损伤后的多巴胺能神经元有挽救,促进恢复,促进存活,促进对多巴胺高亲和力摄取等作用,有效保护中脑的多巴胺循环,预防体内多巴胺能神经元的退行性病变。GDNF在体内微量释放后,通过逆行转运或旁分泌作用对支配其活动的神经元起营养效应。不仅如此,人们还用GDNF直接体内注射或基因治疗方法对帕帕金森病(PD)等疾病进行实验治疗。GDNF在大鼠脑中的表达主要见于中脑黑质神经元的靶细胞,如纹状体、丘脑核等,起靶源性神经营养因子作用。使用GDNF治疗PD有多种途径,(1)直接注入脑内,如Lapchak等用6-羟基多巴胺在黑质注射4周后,再次注入GDNF1周后动物行为得到改善,5周后DA含量增加3倍。Tomac等脑室注射GDNF后,酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞和神经突起数目增加。(2)脑组织移植,如Wang和Rosenblad等用胚胎腹侧中脑细胞悬液移植PD大鼠模型中脑黑质的同时,向该部位或沿黑质纹状体通路灌入GDNF,可见TH阳性细胞数和纤维突起密度与GDNF剂量呈相关性增长,大鼠旋转行为好转。这些研究说明外源性GDNF能改善胚胎黑质多巴胺能神经元的存活、生长和功能。(3)GDNF转基因组织脑内移植,Sautter等用GDNF基因转染雪旺氏细胞系SCTM41后与胚胎多巴胺能神经元共培养后植入纹状体和黑质均能提高移植细胞的存活,改善突起进入宿主神经纤维网,移植物中TH阳性细胞增加2.6倍,而且移植物周围TH阳性纤维增加了53%。上述方法均不能获得GDNF对靶细胞的持续作用。(4)只有用exvivo方法在体外获得GDNF转基因细胞后再移植入大鼠脑内,或用exvivo方法将携带GDNF基因的病毒性载体直接注射入脑内,在不同程度上都能达到这一目的。在对PD的NSC移植治疗中,移植细胞的数量及多巴胺能神经元的分化比率是必须解决的问题。因此,简便而又有效的NSC的体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化是解决问题的关键所在。诱导方式及诱导剂的选择相当重要,在对多巴胺能神经元的体外诱导研究中,细胞因子的作用一直备受关注。结果本实验采用GDNF体外诱导小鼠中脑NSC,观测中脑NSC分化为TH阳性神经元的情况,结果实验组促进M-NSCs分化为TH阳性神经元的比例为13.53%,而对照组仅3.46%,有显著差异(P<0.01)。结果证明GDNF能明显提高中脑NSC分化为TH阳性神经元的比例,GDNF实验组较对照组有显著性差异;而且形态成熟,说明GDNF对TH阳性神经元的发育及营养作用显著。其具体作用机制可能是通过跨膜信息传递作用即受体介导才能实现的,GDNF与锚定在细胞表面的蛋白分子特异性结合,促使原癌基因cret编码的产物蛋白Ret磷酸化,磷酸化的Ret活其下游的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等,导致一系列胞内途径的激活,从而发挥其神经营养因子的生理功能。但对于GDNF能否促进NSC向多巴胺能神经元分化各家结果报道不一,Roussa等的结果显示神经球分化为TH+神经元的数量不受GDNF处理的影响,而在Sun等的研究中,GDNF处理后的TH阳性神经元数量较对照组提高8倍。本实验则较对照组提高4倍。造成结果差异的原因,可能与材料的来源,对NSC增殖阶段的处理,诱导时间的长短以及所用剂量不同等有关。本实验用GDNF体外成功地对中脑NSC进行了定向诱导,为体外获得足够量的形态及功能成熟的多巴胺能神经元用于移植治疗PD等提供了依据。结论 GDNF可明显促进M-NSCs分化成多巴胺能神经元。更多还原