大鼠星形胶质细胞体外培养划伤模型的建立

【作者】 师忠芳； 袁芳； 董丽萍； 徐立新； 韩明；

【机构】 首都医科大学北京市神经外科研究所；

【摘要】 目的建立大鼠星形胶质细胞(astrocyte,AST)体外培养划伤模型。方法取新生1-2 d Wistar大鼠皮层进行AST原代培养,约10天后传代,传代培养至10天左右,用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色检测鉴定AST的纯度,并用白色无菌Tips头进行划伤实验。在六孔培养板中呈"#"字划伤,划痕线之间的平行间距为0.5厘米。分别于划伤前1小时、划伤后1、3、6、12、24小时在倒置相差显微镜下观察对照组和实验组细胞形态的变化,并取其培养上清0.1毫升进行LDH活性测定;划伤后24小时取培养细胞按照Bradford法进行蛋白测定。结果 (1)GFAP免疫组化证实培养细胞中AST达95%以上。(2)显微镜下观察对照组细胞在实验24小时内其形态没有变化。实验组在划伤当时及划伤后1、3小时,划痕两侧边缘整齐,部分细胞形态由扁平形变为不规则形,部分细胞结构不完整;划伤后6小时划痕两侧开始出现细胞突起向划痕区延伸;划伤后12、24小时向划痕区延伸的细胞突起增多,且划痕区出现AST生长;划伤后3天AST基本铺满划痕区。(3)对照组(n=9)在实验各时间点的LDH/pro值分别为41.16±4.9、43.10±4.66、44.68±550、47.88±5.85、52.62±5.59和57.77±5.87(U/mg),说明对照组LDH漏出在3小时内缓慢增加(P>0.05),但在6小时后增加明显(P<0.05)。实验组(n=9)各时间点的LDH/pro值分别为40.85±3.34、48.79±3.35、50.92±3.69、53.38±3.96、58.70±3.85和62.16±2.65(U/mg),划伤后各时间点的LDH/pro值均高于划伤前1小时(P<0.05),说明细胞划伤后其LDH漏出会急剧增加,在12小时达平台期。实验组与对照组比,划伤前1小时两组LDH/pro值没有差异(P>0.05),但划伤后各时间点实验组都高于对照组LDH/pro(P<0.05)。结论通过观察细胞形态变化及测定培养上清中LDH漏出与细胞pro的比值,证实我们已成功建立了大鼠AST体外培养划伤模型。更多还原