β-分泌酶底物竞争性抑制剂对AD模型细胞的保护作用

【作者】 胡海涛； 崔媛媛；

【机构】 西安交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系； 西安医学院组织学与胚胎学教研室；

【摘要】 目的在于探讨从基因克隆着手,构建β-分泌酶底物竞争性抑制剂-BACE底物肽(BACEsp)基因逆转录载体,并检测逆转录病毒介导BACEsp基因感染阿尔茨海默病(AD)模型细胞后,细胞活性的变化,从而为AD的基因治疗提供理论和实验依据。方法 PCR合成BACEsp基因,经测序正确后,插入pMD18-T SimpleVector扩增,得到pMD-T-BACEsp;限制酶切pLXSN及pMD-T-BACEsp二质粒,取相关片段构建含BACEsp基因的逆转录病毒载体pLXSN-BACEsp(pLXSN+pMD-T-BACEsp)后,应用脂质体lipofectamine 2000TM试剂,转染pLXSN-BACEsp质粒进入包装细胞RETRO PACK PT67细胞,转染时同时转染pLXSN-EGFP(pLXSN+EGFP)作为平行对照;48 h后收集上清,分别感染神经母细胞瘤细胞SK-N-SH及经APP诱导的AD模型细胞。结果经pLXSN-EGFP转染的PT67细胞内,可观察到绿荧光表达;设计引物可从pLXSN-BACEsp转染的PT67细胞及pLXSN-BACEsp病毒液感染的SK细胞和AD模型细胞基因组中扩增出BACEsp基因;经APP诱导的AD模型细胞,其细胞活力明显下降,与正常对照组比较有显著性差异,而以BACEsp基因先行整合入SK细胞,再以APP作用,则细胞活力与正常对照组无显著性差异,且其APP的免疫细胞化学染色强度显著高于经APP诱导的AD模型细胞。结论我们已成功地构建了含BACE底物肽的逆转录病毒载体pLXSN-BACEsp,该载体转染入PT67细胞后成功地生产出含目的 BACEsp基因的逆转录病毒,该逆转录病毒能介导BACEsp基因感染SK细胞及经APP诱导的AD模型细胞,并在细胞内表达,与APP竞争性结合β-分泌酶,从而减少β-分泌酶对APP的裂解,减少Aβ的生成,起到对AD的预防性保护作用。更多还原