MyoX参与Netrin-1介导的GnRH神经细胞迁移的研究

【作者】 王俊杰； 伏秀青； 熊文诚； 高倩倩； 王兴智； 朱筱娟；

【机构】 东北师范大学遗传与细胞研究所； 美国佐治亚医学院神经科学系；

【摘要】 脊椎动物胚胎发育过程中,嗅板产生四种不同的神经表型,包括嗅受体神经元、外激素受体神经元,促性腺释放激素(Gonadotropin releasing-hormone,GnRH)神经元和γ敏感神经元。GnRH神经元沿着嗅神经末端迁移到筛板,然后到达它们的目的地丘脑下部。GnRH细胞不能正确迁移将导致嗅觉丧失和性成熟缺陷。小鼠大部分的GnRH细胞迁移发生在胚胎期的12-17天,胞外信号因子HGF、FGF、Netrin-1等导向GnRH神经细胞的迁移,但其分子机制并不明确。近来的研究工作表明,肌球蛋白X(MyosinX,MyoX)调节Netrin-1受体DCC的功能。MyoX是存在于脊椎动物组织的马达蛋白,分子量约240 kDa,脑中还存在缺少头部结构域的MyoX,分子量约160-170 kDa,作为天然存在的显性失活,它在神经发育过程的意义还不清除。本研究利用体外培养的GnRH细胞系,探讨MyoX在Netrin-1介导的GnRH细胞迁移过程中的作用。利用转基因技术建立的GnRH细胞系包括Gn10、GN11、NLT和GT细胞系,其中NLT和Gn10、GN1 1细胞来源于嗅区迁移的神经元,分泌低水平的GnRH,具有迁移能力,表达DCC、neogenin和MyoX,是研究MyoX调节神经细胞迁移良好的模型。我们选取NLT细胞建立了稳定表达EGFP-MyoX全长(full length,FL)和EGFP-MyoX显性失活(DominantNegative,DN)的细胞系,分析MyoX对细胞移动的影响。采用悬滴法培养的MyoX DN细胞团分析细胞迁移能力,以未转染和稳定表达EGFP的NLT细胞作为对照。在胶原立体分析实验中,将105/20 uL的MyoX DN细胞悬滴培养24小时成团,用浓度3 mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原包埋固定在24孔细胞培养板中,加入含1%FBS的DMEM培养基覆盖细胞团。培养48小时后,未转染细胞和转染EGFP细胞呈放射状由细胞团向四周迁出,胞体细长前端生成前导突,后端具有尾随突起,Myo X DN细胞与对照细胞相比迁移数目较少,且迁移距离较短。用多聚甲醛固定各组细胞团,相差显微镜下观察拍照,Image J V1.37C软件测量细胞团边缘到迁移细胞前导缘的距离,计算每个团中所有细胞迁移距离之和及迁移细胞数量,每组取6-8个细胞团进行数据分析。通过数据分析得出每个细胞团细胞迁移数目,NLT为135.625±18.47个,EGFP为204±21.84个,MyoX DN细胞团平均细胞迁移数目为85.50±9.18个。平均每个细胞团细胞迁移距离总和NLT为31281.515±4465.17μm,EGFP为43605.00±6140.41μm,MyoX DN为13927.35±2808.43μm,EGFP-MyoX DN与对照组之间相比有显著差异(P<0.05)。这些结果表明MyoX DN对细胞的迁移具有抑制作用。进一步,我们将利用Boyden Chamber细胞穿膜实验来比较各个稳定系间细胞迁移能力的变化。还将通过Netrin-1分泌细胞团共培养和BoydenChamber诱导穿膜实验来检测各稳定系中MyoX对于Netrin-1介导的GnRH神经细胞迁移的影响。更多还原