大鼠神经干细胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达及其调节

【作者】 邢莹； 赵庆霞； 许燕； 郭思； 姜媛媛； 韩雪飞； 鄢文海；

【机构】 郑州大学基础医学院；

【摘要】 已有研究证实,在脑内成熟的神经元中有GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达,且Aβ_25-35和人参皂苷Rb1对它们的表达均有调节作用,但对于由神经干细胞诱导分化而来的神经元却未见相关研究报道。为此在本实验中我们采用免疫荧光细胞化学染色和RT-PCR技术检测大鼠神经干细胞诱导分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达以及Aβ_25-35和人参皂苷Rb1对它们的调节作用。从新生24h大鼠海马齿状回分离培养神经干细胞,并将第3代的神经干细胞诱导分化,对诱导分化1 week的细胞进行实验分组:（1）正常组:不另加处理因素,继续培养36 h;（2）Aβ_25-35处理组:不加处理因素,培养24 h后,加入凝聚态Aβ_25-35（20μmol/L）继续培养12 h;（3）人参皂苷Rb1预处理组:先加入人参皂苷Rb1（10μmol/L）预处理24 h,再加入凝聚态Aβ_25-35（20μmol/L）继续作用12 h。统一收集各组细胞进行实验检测。应用免疫荧光细胞化学染色观察PP2A以及活化型GSK-3β（pTyr279,216）的表达;采用RT-PCR技术检测神经干细胞分化过程中GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表达。自新生大鼠海马齿状回新鲜分离的单个神经干细胞呈透亮的圆形,数量较少,杂质较多。传至第3代（约3周左右）神经球明显增大,杂质已基本消除。细胞免疫化学染色发现,神经干细胞标记性蛋白Nestin在原代和传代培养神经球中均有表达。神经干细胞诱导分化7 d后,悬浮状态生长的神经球已经贴壁,且神经球中有大量细胞向外迁移,并形成长突起,相互交织成网状。免疫细胞化学检测显示,诱导分化后的神经细胞表达神经元特异性表面标志NSE和星形胶质细胞特异性表面标志GFAP。免疫荧光细胞化学染色结果显示,正常组细胞有PP2A和GSK-3β（pTyr279,216）的表达,Aβ_25-35组和人参皂苷Rb1预处理组细胞PP2A的表达均减弱,其中Aβ_25-35组最弱;而Aβ_25-35组和人参皂苷Rb1预处理组细胞内活化型GSK-3β（pTyr279,216）的表达均高于正常组,其中Aβ_25-35组表达最强。RT-PCR结果发现,正常组细胞均有GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表达。Aβ_25-35组和Rb1预处理组都有强于正常组的GSK-3β和CDK-5的mRNA表达,且它们在Aβ25～35组表达最强,而PP2A的mRNA在Aβ_25-35组和Rb1预处理组的表达都低于正常组,在Aβ_25-35组的表达最弱。本实验中,神经干细胞诱导分化后均有GSK-3β、CDK-5和PP2A的表达,且Aβ_25-35和人参皂苷Rb1对体外培养的神经干细胞分化后GSK-3β、CDK-5和PP2A的mRNA表达有调节作用,这与以往对脑内成熟神经元的研究结果是一致的。说明由体外神经干细胞分化而来的神经元具有与脑内成熟神经元所有的tau蛋白磷酸化调节系统,有利于tau蛋白磷酸化水平的调节研究以及为Alzheimer病的预防奠定基础。更多还原