缺氧诱导体外培养的大鼠胚胎脑皮质神经千细胞增殖和代谢性谷氨酸受体表达的研究

【作者】 陈新林； 刘勇； 田玉梅； 田英芳； 张军峰； 姚璐； 章海霞；

【机构】 西安交通大学医学院神经生物学研究所；

【摘要】 目的脑缺血缺氧损伤后产生各种生长因子和神经递质可诱导在体神经干细胞增殖、迁移和分化,有可能促进损伤修复和神经功能重建。近年的研究提示代谢性谷氨酸受体(mGluRs)可能在正常神经发生和缺血缺氧损伤后的神经发生中发挥着重要作用。本研究应用体外培养技术,研究缺氧损伤对神经干细胞增殖的影响,探讨缺氧损伤后神经干细胞mGluRs的表达变化规律。方法分离大鼠E15.5d胚胎脑皮质,采用无血清体系,体外培养成神经干细胞球。nestin、Tujl、GFAP和O4免疫荧光染色鉴定培养的神经干细胞;培养的神经干细胞球置入含95%N2,5%CO2的厌氧培养箱中制备缺氧模型,分别缺氧处理3h、6h、12h和24h后再转入普通CO2培养箱中,进行常氧培养;应用MTT分析,克隆形成率,神经干细胞球直径测量方法显示神经干细胞增殖数量变化;流式细胞术分析细胞周期变化,Western Blot分析细胞周期素D1(cyclinD1)表达变化。实时定量PCR测定神经干细胞的mGluRs mRNA表达变化;One-Way ANOVA方法统计分析实验数据。结果培养的神经干细胞球为nestin染色阳性,并可诱导分化为Tuj1、GFAP和O4阳性细胞。MTT分析显示缺氧12h和24h后,其OD492值较对照组显著增高;缺氧处理6h和12h的神经干细胞克隆形成率高于对照组;缺氧处理12h和24h神经干细胞球增长速度明显加快;细胞周期分析提示缺氧6h、12h和24h后G2/M期细胞比例较常氧培养细胞增高,cyclinD1表达量增加。RT-PCR显示体外培养的神经干细胞可表达所有8型mGLuRs;实时定量PCR显示:mGluR2和mGluR7 mRNA转录在所有的缺氧时间点均有显著增高mGluR1、mGluR3、mGluR5、mGluR6和mGluR8mRNA在缺氧24h后增高;mGluR4 mRNA转录不受缺氧处理的影响。结论缺氧损伤可诱导体外培养的神经干细胞增殖,提高其增殖潜能。体外培养的胚胎皮质神经干细胞可表达所有8个亚型的mGluRs mRNA,缺氧损伤可使其表达水平提高,提示mGluRs的某些亚型可能在缺氧诱导的神经干细胞增殖分化中发挥重要的调节作用。更多还原