包涵体颗粒的场流分级技术研究

【作者】 罗坚； 陈毅； 苏志国；

【机构】 中国科学院过程工程研究所；

【摘要】 目的:在以原核生物如大肠杆菌等为载体进行外源基因表达的过程中常常会在细胞内形成重组蛋白的包涵体(Inclusion Bodies,IBs)。包涵体的结构、理化性质以及在细胞中所处的位置对重组蛋白的分离和制备有重要的影响。包涵体颗粒的大小通常在400到1200 nm之间,常规分离方法如凝胶过滤法的分离范围窄很难有效实现包涵体颗粒的分级分析;而超速离心法分离的成本高且耗费的时间长。场流分级(Field FlowFractionation,FFF)的分离范围广、分离精度高且分离速度快,可用于包涵体颗粒的性质分析研究。方法:将场流分级与多角度激光散射仪在线耦联是大分子分析中普遍采用的一种强有力的方法。基于水力学半径的差异可实现样品的分级分离,通过多角度激光散射仪可得到样品的旋转半径和摩尔质量的数据,在一次实验中可同时得到样品粒子的结构和摩尔质量的分布信息。结果:建立了非对称垂直流场流分级(Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation,AsFlFFF)与多角度激光散射(Multi-Angle Laser Light Scattering,MALLS)耦联的分析方法,对绿色荧光蛋白包涵体颗粒的粒径分布及形状等性质进行研究。首先,通过聚苯乙烯标准粒子实验,确定了场流分级由常规模式向空间模式转变的反转粒径,约为930nm左右,并给出常规分级模式的标准曲线;其次,考察了操作流速和上样量对包涵体颗粒场流分级分离精度的影响,确定了优化的操作流速(Fc=Fout=0.3 mL/min)和上样量(25μL);最后,通过场流分级与多角度激光散射耦联的方法确定了包涵体颗粒的方均根半径在130-280 nm之间,颗粒形状近似为球形,并测定了基因工程菌在不同培养条件下形成的绿色荧光蛋白包涵体的粒径分布和结构信息。结论:采用非对称垂直流场流分级与多角度激光散射耦联方法可以确定包涵体颗粒的尺寸和结构信息,结果表明包涵体颗粒呈球形,方均根半径在130-280 nm之间,不同培养条件下形成的绿色荧光蛋白包涵体颗粒的粒径分布有显著差异。更多还原