【作者】 周颖； 黄慧强； 蔡清清； 林旭滨； 高岩； 卜庆； 王潇潇； 林泽晓；

【Author】 Zhou Ying,Huang hui-qiang,Cai qing-qing,Lin xu-bin,Gao yan,Bo qing,Wang xiao-xiao,Lin ze-xiao

【机构】 中山大学肿瘤医院内科华南肿瘤学国家重点实验室；

【摘要】 目的目前非霍奇金淋巴瘤的发病率有逐渐上升的趋势。2008年,美国非霍奇金淋巴瘤的发病率在全部恶性肿瘤中排名上升至第五位。根据细胞来源分类,非霍奇金淋巴瘤主要可分为B细胞非霍奇金淋巴瘤淋巴瘤,T及NK细胞淋巴瘤。PTCL是T细胞淋巴瘤中最常见的一种亚型,占所有T细胞淋巴瘤的60%-70%。除外个别亚型（如ALK阳性的间变大细胞淋巴瘤,anaplastic large cell lymphoma,ALCL）,T细胞淋巴瘤的生物学行为与最常见的弥漫大B细胞性淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma,DLBCL）不同,往往表现为化疗敏感性差、容易复发和预后不良,目前尚无标准化疗方案,化疗的选择多参考DLBCL的治疗经验。目前侵袭性非霍奇金淋巴瘤一线化疗方案CHOP治疗PTCL疗效较差,CR率在20%—40%左右,5年生存率20%左右。采用持续静脉滴注的EPOCH方案化疗,CR率在30%—50%左右,但仍然有较高的复发率。对于初治高危的患者及复发/难治性患者在常规化疗获得缓解后加用自体造血干细胞移植,不少学者进行了许多临床研究,结果显示AHSCT可使15%—50%复发的患者获得长期无病生存,但仍有一半以上的患者在移植后复发。靶向治疗是目前肿瘤治疗领域研究的热点,CD₂₀单克隆抗体的应用大大提高了B细胞非霍奇金淋巴瘤的有效率和生存率,这是淋巴瘤靶向治疗成功的典范,目前很多针对T细胞淋巴瘤的单克隆抗体也在研究当中,但到目前为止仍没有推荐用于一线治疗PTCL的单克隆抗体,CD₅₂单克隆抗体Alemtuzumab（Campath-1H）目前仅批准用于PTCL的二线治疗。总之,相对于B-NHL,T-NHL生物学行为复杂,治疗效果差,容易复发,需要寻找新的治疗手段和药物。Alemtuzumab（Campath-1H）是人源化的抗CD₅₂的单克隆抗体,其对烷化剂及氟达拉滨耐药的慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia,B-CLL）患者仍有较高的有效率及有效维持时间,是治疗高危初治B-CLL及复发/难治性B-CLL的有效药物。并且对复发/难治性幼淋巴细胞白血病（T-cell prolymphocytic leukemia,T-PLL）、Sezary综合征（Sezary syndrome）、外周T细胞淋巴瘤（peripheral T cell lymphoma,PTCL）也有一定的疗效。蛋白酶体抑制剂Bortezomib（Velcade）是哺乳动物细胞中26S蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂。体外试验证明Bortezomib对多种类型的癌细胞具有细胞毒性。多项临床试验结果说明,Bortezomib治疗各种实体瘤和淋巴血液系统肿瘤均有一定的疗效。mTOR抑制剂Sirolimus（Rapamycin）是最早被发现的mTOR抑制剂,目前在许多肿瘤组织培养和动物模型中,Rapamycin均具有浓度依赖性的抑制肿瘤细胞生长的活性,例如白血病、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、小细胞肺癌和肝癌等。目前,关于Rapamycin治疗淋巴瘤正在进行的临床试验有Rapamycin治疗初治/复发/难治套细胞淋巴瘤Ⅱ期临床试验;Rapamycin治疗复发难治淋巴瘤Ⅰ/Ⅱ期临床试验等。体内外试验均显示其对各种类型的肿瘤均有一定的抑制作用。As₂O₃（Arsenic trioxide,ATO）对急性早幼粒细胞白血病特别的疗效是中国学者在血液学研究领域内的重大突破。不仅在血液病中,ATO治疗各种类型淋巴瘤也显示出一定的临床疗效,值得进一步深入研究。综上所述,Alemtuzumab、Bortezomib、Sirolimus以及Arsenic trioxide都是近年来出现的治疗淋巴瘤很有前景的药物,因此,本研究的目的在于探讨Alemtuzumab、Bortezomib、Sirolimus以及Arsenic trioxide单药和联合应用对人T细胞淋巴瘤细胞株的抗瘤活性,并通过不同药物组合方式,进一步了解其相互作用,找寻最佳的药物组合。材料和方法取对数生长期的细胞进行实验,应用Campath-1H、VCR、ATO、Velcade和Rapamycin对细胞进行处理,实验分为空白对照组、单用Campath-1H、VCR、ATO、Velcade以及Rapamycin治疗组,Campath-1H分别和其它药物的两药联合组、Velcade分别和其它药物的两药联合组、Rapamycin分别和其它药物的两药联合组检测药物对肿瘤的抑制作用。结果结果显示采用20ug/ml的Campath-1H对B-CLL患者的PBMCs作用48小时,抑制率为（14.1613±0.015）%。采用20ug/ml的Campath-1H以及25%健康人血清对B-CLL患者的PBMCs作用48小时,其抑制率为（16.4854±-0.027）%。Campath-1H以20ug/ml的浓度分别与ATO、VCR联合作用于B-CLL患者的PBMCs,结果显示Campath-1H联合VCR对B-CLL患者的PBMCs有明显拮抗的作用;Campath-1H联合ATO对B-CLL患者的PBMCs有拮抗的作用。当加入25%健康人血清作为补体后,Campath-1H联合VCR对B-CLL患者的PBMCs的作用仍是明显拮抗;Campath-1H联合ATO对B-CLL患者的PBMCs的作用仍是拮抗。Campath-1H以20ug/ml的浓度分别与Velcade、Rapamycin联合作用于B-CLL患者的PBMCs,结果显示,Campath-1H联合Velcade对B-CLL患者的PBMCs的作用是拮抗;Campath-1H联合Rapamycin对B-CLL患者的PBMCs的作用是拮抗。当加入25%健康人血清作为补体后,Campath-1H联合Velcade对B-CLL患者的PBMCs的作用仍是拮抗;Campath-1H联合Rapamycin对B-CLL患者的PBMCs的作用仍是拮抗。Campath-1H以1ug/ml、5ug/ml、25ug/ml以及125ug/ml的浓度对处于对数生长期的人T细胞淋巴瘤HUT-78、Jurkat细胞株作用48h,各Campath-1H组和空白组的OD值差异无统计学意义,各浓度的Campath-1H组之间的OD值差异无统计学意义,即Campath-1H单药对人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞株没有抑制作用,增加药物浓度后抑制率没有提高。Campath-1H以10ug/ml的浓度分别与不同浓度的ATO、VCR联合作用于人T细胞淋巴瘤HUT-78、Jurkat细胞株48h,结果显示Campath-1H联合0.25umol/1 ATO对人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞株为拮抗作用,Campath-1H联合0.5umol/l ATO对人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞株为相加作用;Campath-1H联合ATO对人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞株为相加作用。Campath-1H联合VCR对人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞株为相加作用;Campath-1H联合VCR对人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞株为相加作用。Campath-1H以10ug/ml的浓度分别与不同浓度的Velcade、Rapamycin联合作用于人T细胞淋巴瘤HUT-78、Jurkat细胞株48h,结果显示Campath-1H联合Velcade对人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞株为拮抗作用;Campath-1H联合Velcade对人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞株为相加作用。Campath-1H联合6.25ng/ml的Rapamycin对人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞株为相加作用,Campath-1H联合12.5ng/ml的Rapamycin对人T细胞淋巴瘤HUT-78细胞株为拮抗作用;Campath-1H联合Rapamycin对人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞株为拮抗作用。Velcade单药分别与化疗药ATO、VCR以不同浓度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat细胞株,结果显示Velcade和ATO、VCR联合作用于Hut-78、Jurkat细胞株的联合系数均<1,提示Velcade和ATO、VCR联合均有协同作用。Velcade单药与Rapamycin以不同浓度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat细胞株,结果显示:Velcade和Rapamycin联合作用于Hut-78、Jurkat细胞株的联合系数<1,提示Velcade和Rapamycin联合有协同作用。Rapamycin单药分别与化疗药ATO、VCR以不同浓度梯度按一定比例混合共同作用于Hut-78、Jurkat细胞株,结果显示Rapamycin和ATO、VCR联合作用于Hut-78、Jurkat细胞株的联合系数均<1,提示Rapamycin和ATO、VCR联合均有协同作用。采用流式细胞技术测定空白对照组、单用Rituximab组、单用Campath-1H组、单用DDP组、单用VCR组、Campath-1H联合DDP组、Campath-1H联合VCR组的凋亡比例,B-CLL细胞经药物作用48h后,结果提示Rituximab单药、DDP单药、VCR单药对B-CLL患者具有一定的诱导凋亡的作用,Campath-1H单药作用于B-CLL细胞未见到有明显的诱导凋亡作用,但Campath-1H联合DDP、Campath-1H联合VCR观察到相对于单用DDP、VCR,诱导凋亡的作用反而更下降。设定空白对照组、单用Campath-1H组、单用ATO组、Campath-1H联合ATO组、单用VCR组、Campath-1H联合VCR组、单用Velcade组、Campath-1H联合Velcade组、单用Rapamycin组、Campath-1H联合Rapamycin组,HUT-78细胞经药物作用48小时后,结果提示Campath-1H单药作用于HUT-78细胞未见明显诱导凋亡的作用;Campath-1H联合ATO可见提高ATO诱导凋亡的作用;Campath-1H联合VCR未见明显协同作用;Campath-1H联合Velcade与单用Velcade相比,细胞凋亡比率下降;Campath-1H联合Rapamycin与单用Rapamycin相比,细胞凋亡比率下降。设定空白对照组、单用Campath-1H组、单用ATO组、Campath-1H联合ATO组、单用VCR组、Campath-1H联合VCR组、单用Velcade组、Campath-1H联合Velcade组、单用Rapamycin组、Campath-1H联合Rapamycin组,Jurkat细胞经药物作用48小时后,结果提示Campath-1H单药作用于Jurkat细胞未见明显诱导凋亡的作用;Campath-1H联合ATO可见提高ATO诱导凋亡的作用;Campath-1H联合VCR未见明显协同作用;Campath-1H联合Velcade未见明显协同作用;Campath-1H联合Rapamycin与单用Rapamycin相比,细胞凋亡比率下降。结论在本实验中,Campath-1H对B-CLL患者的PBMC具有一定的抑制作用,但与药物浓度无明显关系;上述试验中加入健康人血清后,凋亡比率未见提高;Campath-1H与化疗药物ATO、VCR作用于B-CLL患者的PBMCs均提示有拮抗作用:Campath-1H与靶向药物Velcade、Rapamycin作用于B-CLL患者的PBMCs均提示有拮抗作用;本实验中,Campath-1H单药作用于人T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78和Jurkat未见到诱导凋亡的作用;Campath-1H与化疗药物ATO、VCR作用于人T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78和Jurkat均未见到协同作用;Campath-1H与靶向药物Velcade、Rapamycin作用于人T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78和Jurkat均未见到协同作用;在本实验中,Velcade与化疗药物ATO、VCR,靶向药物Rapamycin作用于人T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78和Jurkat均提示有协同作用;Rapamycin联合化疗药物ATO、VCR,作用于人T细胞淋巴瘤细胞株HUT-78和Jurkat均提示有协同作用更多还原