高通量基因克隆、表达技术平台建立以及对变形链球菌若干蛋白的晶体结构研究

【作者】 李兰芬； 张晓嫣； 南洁； 梁宇和； 郭丽宏； 林久祥； 魏世成； 苏晓东；

【机构】 北京大学生命科学学院； 北京大学口腔医学院； 北京大学蛋白质科学中心；

【摘要】 <正>目的:为搭建适合于国内结构基因组研究的高通量、低成本基因克隆、蛋白表达、纯化、晶体筛选、X-射线晶体衍射技术平台,寻找适合于变形链球菌蛋白高效表达的体系和条件,对变形链球菌ATCC25175国际标准株中27个和全基因组测序株UA159中近300个基因依次选取进行试验。方法:对比手工操作或利用Beckman-Coulter Biomek FX机器人进行大规模蛋白质生产先期研究,实验流程包括:制备变形链球菌基因组DNA模板,筛选靶基因,自动化引物设计,PCR体外扩增基因,常规克隆将片段插入表达载体pET28a中,IPTG诱导异源蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶性大量表达,His6标签镍亲和层析-分子筛两步法纯化重组蛋白,浓缩蛋白(约10 mg/ml),经悬滴或坐滴法一汽象扩散技术筛选更多还原