环境水平的PAHs暴露引发心脏毒性及其分子机制

【作者】 黄力行； 王重刚； 章幼玉； 杨志兵； 张诗琦； 左正宏；

【机构】 厦门大学生命科学学院；

【摘要】 多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）是一类广泛分布于环境中的持久性有机污染物。众多研究表明,PAHs不仅具有较强的致癌、致畸和致突变性,还具有胚胎发育毒性,尤其是心脏发育毒性。但到目前为止,PAHs心脏毒性的研究多集中于高浓度的急性暴露,而对环境浓度的PAHs暴露是否会同样的引发心脏发育毒性,研究还甚少。本研究分别选取菲（Phenanthrene,Phe）,和芘（Pyrene,Pyr）在环境水平下暴露斑马鱼胚胎、新生大鼠、以及H9C2细胞,应用生态毒理学和分子生物学技术检测其对心脏发育的毒性效应,旨在探讨:（1）环境浓度的Phe、Pyr暴露是否同样会引发心脏发育缺陷;（2）比较Phe、Pyr暴露对鱼类心脏发育毒性效应的差异;（3）比较分析其可能的作用机制。结果显示:1)斑马鱼受精卵在环境水平的Phe暴露下,在胚胎发育过程中,各处理组心脏均产生一定的畸形,且总的心脏畸形率呈显著性上升,主要畸形特征表现为:心包囊水肿、心房与心室重叠减少、心室扩大等。通过HE染色等组织学方法分析显示,Phe暴露能引起斑马鱼胚胎心室腔变大,心室壁变薄,心室心肌细胞层胶原含量增加等畸形。同时,与心脏形态形成相关的MMP-9基因,不论是转录水平、蛋白水平还是蛋白活性均呈显著性上升,且通过使用MMP-9抑制剂特异性的抑制MMP-9活性,Phe暴露引发的心脏发育缺陷在很大程度上得到了缓解。另外,心室细胞层中,在心肌纤维化过程中与胶原合成密切相关的调控因子TGF-B的表达也呈显著性上升。这些结果表明,Phe暴露可能通过诱导MMP-9表达、增加MMP-9活性,促进心肌细胞间质ECM降解、导致腔室壁变薄;Phe暴露同时诱发TGF-β1调节的胶原合成的增加,最终导致心脏畸形。2)环境浓度的Phe暴露不仅对心脏形态发育产生不良影响,同时也导致心脏机能障碍。Phe暴露72h,各处理组心跳速度呈显著性上升,且表现出严重的不规律性,舒张/改缩末期容积（EDV、ESV）上升,每搏输出量（SV）下降,心输出量（CO）减少等。通过体外暴露大鼠心肌细胞研究发现,Phe暴露导致细胞胞浆内Ca²⁺滞留严重,Ca²⁺浓度呈显著性上升,而肌浆网内储存的Ca²⁺则明显减少;肌浆网钙泵ATP酶SERCA2a基因转录水平、蛋白表达及其活性均显著性下降;另外,SERCA2a的一个重要调节因子Tbx5的表达也显著性下降。这些结果表明,Phe可能通过抑制Tbx5表达,使得SERCA2a表达降低,心肌细胞肌浆网对胞浆中Ca²⁺摄取减少,胞浆中Ca²⁺滞留而扰乱了心肌细胞内钙离子平衡,最终导致收缩、舒张紊乱并引发心率不齐。3)环境浓度的Pyr暴露引发与Phe类似的心脏发育毒性,如:心包囊水肿,心脏非正常环化,心室壁变薄,心室细胞层胶原含量增加,心跳加快等。但是Pyr暴露72h,EDV、ESV均表现出不同程度的下降趋势,且都在50 nM呈显著性下降,SV在50 nM处理组显著性减小,CO则没有发生明显的变化。然而,在作用机制上Pyr和Phe却不尽相同,Pyr暴露并不会引起斑马鱼胚胎MMP-9基因表达的变化,Bmp2b,Nkx2.5基因的表达却都呈显著性下降。因此,Pyr暴露可能是通过影响Bmp2b的表达调节Nkx2.5,从而影响心脏心肌细胞的分化,进而导致心脏发育缺陷。4)Phe暴露能引起大鼠心脏显著增大,心体比显著上升,心肌细胞体积增加,心肌细胞间质中纤维含量上升。同时,我们证明,Phe暴露能导致H9C2细胞体积增大,蛋白合成水平上升,导致H9C2细胞和大鼠心脏内ANP、BNP以及c-Myc等心肌肥大分子指标显著上升。综上所述,本研究表明环境浓度Phe和Pyr暴露均能在斑马鱼胚胎发育过程中引发类似的心脏发育毒性,但在作用机制上两者却不尽相同。Phe主要是通过MMP-9介导的相关途径诱发心脏发育缺陷和通过扰乱心肌细胞Ca²⁺平衡引发心脏功能障碍,而Pyr可能是通过Bmp2b-Nkx2.5途径而发生作用的。同时,本研究在体内和体外模型上均证实了Phe暴露能导致心肌肥大。其机制可能是Phe经由诱导miR-133a上游启动子序列的甲基化,进而抑制miR-133a的表达,从而促进cdc42和RhoA的表达,最终引发心肌肥大相关的形态学建成和基因表达模式改变。更多还原