核糖体小亚基蛋白S7通过调控MDM2依赖GADD45泛素化降解反应介导砷化物诱导的促细胞凋亡效应

【作者】 高明； 李小光； 董雯； 金蕊； 马航航； 杨平勋； 胡美茹； 李译； 郝一； 宋伦；

【机构】 军事医学科学院基础医学研究所；

【摘要】 目的探讨GADD45在静息状态下维持持续性泛素化降解反应、应激损伤信号刺激作用下终止泛素化降解反应并实现其诱导表达的分子机制。方法采用酵母双杂交系统筛选可能参与GADD45蛋白质稳定性调控的GADD45结合蛋白;采用GST-pull down、免疫荧光、免疫沉淀等方法证实以上信号蛋白在砷化物刺激前后与GADD45的结合反应状态;采用基因过表达和siRNA干扰技术研究以上信号蛋白在GADD45稳定性调控中的作用;采用体外和体内泛素化修饰反应分析系统分析以上信号蛋白在GADD45泛素化修饰反应中的调控作用;采用流式细胞术分析以上信号蛋白和GADD45在介导砷化物诱导细胞凋亡反应中的协同作用及贡献。结果采用酵母双杂交技术筛选得到GADD45相互作用蛋白——核糖体小亚基蛋白S7;并从体外、体内多层次证实了S7在砷化物刺激前后存在有与GADD45的相互结合反应。过表达S7可增强多种细胞中内源及外源性GADD45的蛋白质稳定性,提示S7在GADD45稳定性调控中存在关键作用。由于目前公认的S7核糖体外功能主要表现为参与p53的稳定性调控;而GADD45又是经典的p53下游靶基因,因此为了进一步确定S7对GADD45的表达调控作用是直接发生还是通过p53而间接实现,比较了p53^+/+和p53^-/-细胞中的S7-GADD45信号传递情况,结果证实了S7对GADD45的稳定性调控作用是独立于p53的全新生物学功能。我们在后续体内、体外多重实验中发现了受控于S7的MDM2是GADD45的E3泛素化连接酶,它与S7和GADD45的组成性结合是导致静息细胞中GADD45发生组成性泛素化降解反应的关键前提。砷化物刺激后,S7与MDM2结合能力显著提升,致使MDM2介导的GADD45泛素化降解反应被显著抑制,从而实现了GADD45的诱导表达。干扰肿瘤细胞中S7表达水平后可显著抑制GADD45依赖的细胞凋亡反应途径的诱导活化以及砷化物诱导的促细胞凋亡效应;而且以上反应发生强度与阻断GADD45诱导表达后的效应几乎相同;说明S7-MDM2-GADD45信号途径在介导砷化物促细胞凋亡反应中具有重要作用。结论核糖体蛋白S7通过抑制MDM2的E3泛素化连接酶活性从而在细胞静息和砷化物诱导的应激状态下稳定GADD45的调控。更多还原