利用人胚胎干细胞研究三氯乙烯对心肌细胞发育毒性的机制

【作者】 王丹； 张国兴； 王国卿； 陈涛； 童建； 姜岩；

【机构】 苏州大学基础医学与生物科学学院； 苏州大学公共卫生学院；

【摘要】 目的探讨三氯乙烯（TCE）对心肌细胞发育毒性的机制。方法选用人胚胎干细胞（ES）细胞系H9,进行定向心肌细胞分化,TCE作用于整个分化过程,其处理剂量如下:10 ppb,100 ppb,1 ppm,10ppm,只接受DMSO处理组作为对照。分化过程如下:悬浮培养,第0～第3天,BMP4 10μg·L^-1,activin6μg·L^-1,bFGF 5μg·L^-1,第4～第7天,贴壁培养VEGF10μg·L^-1,DKK1 150μg·L^-1,第8～第21天,VEGF 10μg·L^-1和bFGF 5μg·L^-1。收集对照组和不同TCE剂量处理下的不同发育时期的细胞（心肌前体细胞期,成熟心肌细胞期）,提取RNA,应用实时PCR和免疫荧光方法检测各个时期相关基因和蛋白的表达与分布。选取差异显著的剂量组10 ppm成熟心肌细胞进行表达表达谱基因芯片分析。简述如下:总RNA反转录成双链cDNA,进一步合成（Cy3）标记的cRNA和芯片杂交,洗脱后利用Agilent ScannerG2505C扫描得到原始图像。利用倍数变化值进行差异基因筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0。接着,对差异基因进行GO和KEGG富集分析,以判定差异基因主要影响的生物学功能。结果 H9细胞在细胞因子作用下可定向分化为自主搏动的心肌细胞,表达心肌细胞特异性蛋白cTnT和MHC。TCE降低了心肌前体细胞期NXK2.5和GATA4的表达,以及成熟期的心肌细胞中cTnT和a-actinin的表达,但差异不显著（P>0.05）。TCE降低成熟心肌细胞中Cav1.5,Serca2A等与Ca离体通道相关蛋白表达（P<0.05）。表达谱基因芯片结果显示,10 ppm TCE处理显著影响钙离子释放通道相关基因的表达,包括钙泵、Ryanodine受体、L型和T型钙离子电压门控通道、神经肽及肌质网钙磷受体蛋白。结论 TCE通过干扰Ca²⁺通道相关基因的表达,影响心肌细胞分化及其泵血功能,从而使心房、心室和瓣膜的形成受累,可能是TCE对心肌细胞发育毒性的机制之一。更多还原