耐辐射奇球菌pprM DNA结合域基因敲除株的构建

【作者】 杨杰； 苏泽红； 李斌元； 马云； 肖潇； 范美婷； 李伟； 王秋岩； 何淑雅；

【机构】 南华大学公共卫生学院； 南华大学生物化学与分子生物学教研室；

【摘要】 目的构建pprM DNA结合域敲除株DR1△CSP,并分析其在辐射及其他极端环境处理下的抗性变化,探讨pprM的DNA结合功能对于耐辐射奇球菌（DR）菌的辐射抗性作用。方法 （1）运用生物信息学方法对pprM基因、pprM功能结合域及PprM蛋白的理化性质、功能结合域及生物学功能等进行分析与预测。（2）利用体外overlap PCR连接和体内同源重组的方法对DR pprM基因DNA结合域进行基因敲除,γ辐照、紫外辐照、丝裂霉素C和H₂O₂处理后对DR野生株、基因敲除株的生存率等进行分析。初步研究pprM基因DNA结合域对于DR菌辐射抗性是否具有作用。结果 （1）生物信息学分析结果显示,PprM编码蛋白是一种含有Cold-Shock DNA-binding domain（DNA结合域）的DNA结合蛋白。进一步的pprM基因结构分析发现pprM是一种冷休克蛋白基因,冷休克蛋白可作为转录调控因子通过结合于其他其他DNA损伤修复相关基因的启动子区域调控其表达。（2）以耐辐射奇球菌基因组DNA为模板,以overlapPCR的方法获得pprM基因DNA结合域缺失的DNA片段DR1△CSD,将获得的目的片段△CSD与基因敲除载体pk18mobsacB连接,转化大肠杆菌JM109感受态,提取质粒,酶切鉴定及测序鉴定分析,结果显示基因敲除重组载体pk18mobsacB-△CSD构建成功。将重组载体转化DR菌感受态,筛选得到pprM基因DNA结合域敲除株,γ辐照、紫外辐照、丝裂霉素C和H₂O₂处理后基因敲除株与DR野生株相比生存率均下降。结论 （1）生物信息学分析显示pprM含有CSD DNA结合域,推测pprM的DNA结合功能对DR菌的辐射抗性可能具有作用。（2）成功构建耐辐射奇球菌pprM基因DNA结合域敲除重组载体,敲除株对于辐射及其他极端环境的抗性下降,提示pprM的DNA结合功能对DR菌的辐射抗具有作用。更多还原