B(a)P诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中差异甲基化基因的筛选和验证

【作者】 杨萍； 张波； 曾君玲； 王庆； 李道传； 肖勇梅； 陈雯；

【机构】 中山大学公共卫生学院预防医学系；

【摘要】 目的:筛查化学致癌物苯并(a)芘B(a)P在诱导人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中基因启动子区差异甲基化修饰基因,并在肿瘤细胞株和人群肺癌组织中进行验证。方法:用20μM B(a)P染毒16HBE细胞,构建人体细胞恶性转化模型,。选择转化不同阶段细胞:16HBE(人支气管上皮永生化细胞)、16HBENT(B(a)P处理后未转化细胞)、16HBET(B(a)P诱导的恶性转化细胞),采用甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)结合甲基化芯片技术进行分析,采用RT-PCR、甲基转移酶抑制剂5-杂氮胞苷(5-aza)处理、亚硫酸氢盐测序等技术筛选及验证高甲基化修饰的基因。选择50对人肺癌-癌旁组织,用RT-PCR、亚硫酸氢盐测序等技术验证这些基因的mRNA表达和基因甲基化水平。利用siRNA干扰技术构建在人类肿瘤组织中得到验证的低表达基因细胞株,以检测该基因对细胞生长、损伤修复及恶性转化的影响。结果:芯片检测发现738个基因在转化后细胞16HBET中呈现高甲基化状态,其中128个基因在转化中持续甲基化;149个基因在染毒前和转化后为甲基化状态,而在转化前细胞中为非甲基化状态;378个基因仅在转化后细胞中为甲基化状态;83个基因在染毒前(HBER细胞)为非甲基化,而在染毒转化前和转化后为甲基化状态。这83个基因中有8个非编码序列,6个基因未检测到mRNA的表达,52个在转化过程中没有发生变化或变化没有规律;17个基因在转化前和转化后细胞中有显著的下降;其中2个高甲基化位点在肺癌组织中呈高甲基化,并导致基因表达下调。结论:成功构建了B(a)P诱导的细胞恶性转化模型,发现有17个基因在转化过程中并在转化后表达下降并且基因CpG岛启动子高甲基化。部分基因的甲基化调控在肺癌组织中得到验证,揭示了特异基因甲基化调控的基因在恶性转化过程中的重要作用。本研究筛查到的差异高甲基化基因可能是化学物诱导的特异性标志物,有望应用于环境化学物的生物监测。更多还原