新型芋螺毒素K411基因在毕赤酵母中的表达研究

【作者】 高炳淼； 唐天乐； 郑晓冬； 李宝珠； 长孙东亭； 罗素兰；

【机构】 热带生物资源教育部重点实验室(海南大学)；

【摘要】 目的与意义:新型芋螺毒素K411基因是从海南产勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)中发现的,编码产生的成熟肽是由28个氨基酸组成的小肽,含有五个半胱氨酸,具有能阻断乙酰胆碱受体的生物活性。因化学合成K411线性肽之后的氧化折叠异构体产物异常复杂,难以纯化,得率很低,且成本很高。若采用基因工程方法直接真核分泌表达出具有天然构象的活性肽,则会大大降低成本且无须再考虑氧化折叠以及二硫键配对问题。由于毕赤酵母表达系统是目前较完善的高效异源蛋白表达系统,具有高分泌表达、高稳定整合、易于高密度发酵和产物的下游纯化较易等优点。所以本实验采用该系统对芋螺毒素基因K411进行高效表达研究具有非常重要的意义。材料与方法:新型芋螺毒素K411基因是由本实验室从海南产勇士芋螺中克隆获得的。毕赤酵母菌株GS115和表达载体pPICZB、pPICZαA等购自Novagen公司。采用PCR方法从芋螺毒素K411的前体基因中,亚克隆出带有K411本身信号肽序列的、适合与毕赤酵母表达载体连接的目的基因;同时人工合成K411成熟肽基因,分别构建含有芋螺毒素K411本身信号肽和毕赤酵母信号肽序列的目的基因两类酵母表达载体。将构建好的表达载体线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,经Zeocin抗生素筛选和PCR鉴定后获得高拷贝重组子,并利用甲醇进行了诱导表达研究。结果与讨论:1.成功构建了K411基因的5个酵母表达载体,分别为B-K4112,B-K4113,αA-K4145,αA-K4167,αA-K4189。2.获得了高拷贝重组子,并利用甲醇进行了诱导表达,最佳诱导表达时间为72h,培养基选择MGY/MM比BMGY/BMMY诱导表达效果好。3.表达产物经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,在6Kd左右出现一条明显的目的蛋白带。由此可知,新型芋螺毒素K411基因已在毕赤酵母中获得成功表达,有待于下一步分离纯化。更多还原