白唇竹叶青(Trimeresurus albolabris)类凝

【作者】 和七一； 林奕心； 余晓东；

【机构】 重庆动物生物学重点实验室活性物质生物技术教育部工程技术研究中心,重庆师范大学生命科学学院；

【摘要】 在体内蛇毒类凝血酶降解纤维蛋白原产生不交联的纤维蛋白凝胶,此纤维蛋白凝胶极易为纤维蛋白溶解酶所降解,导致血浆中纤维蛋白原浓度显著下降,表现降纤、抗凝效应。因此在临床上用于治疗血栓性疾病等病症。但是临床上使用的类凝血酶制剂系直接从蛇毒液中提取,在质量、成本等方面存在一定的问题,而利用基因工程则有望解决这些问题。本研究以中国白唇竹叶青为对象,根据已有竹叶青属的蛇类中类凝血酶的氨基酸序列或cDNA序列,设计上下游引物,以毒腺总RNA为模板进行RT-PCR,扩增得到一个约817 bp的条带,纯化回收此条带,并克隆至pMD18-T载体并测序,获得该类凝血酶cDNA序列,该序列除合成5’和3’末端引物外,还有一条777 bp编码中国白唇竹叶青类凝血酶的核苷酸序列。比较一级结构不同的类凝血酶分子后发现,各种蛇毒类凝血酶分子具有一些共同的结构特征。分子系统树分析表明,一级结构的分化表现为一定的种属特征。将中国白唇竹叶青类凝血酶(chitribrisin)基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET-32 a(+)中,在T7启动子下表达出融合蛋白,融合部分为硫氧还蛋白,位于类凝血酶基因上游,并在其N端带6×His Tag标签以利于表达产物的分离纯化,经热激转化至宿主菌BL21(DE3)中,终浓度1 mM的IPTG诱导4小时后收获菌体。经SDS-PAGE分析,chitribrisin以可溶性和包含体的形式存在于细胞中,纯化后经SDS-PAGE分析发现得单一条带,分子量约为44KD左右,经EK酶切和分子筛层析得到chitribrisin,分子量约为28 KD左右,进行性质鉴定,发现在体外它具有微弱的凝血活性,但其可降解纤维蛋白原的α和β链,不能降解γ链。更多还原