RNA干扰技术建立人支气管上皮细胞(16HBE)NF-κBp65缺陷模型

【作者】 卫秦芝； 孟晓静； 姚朗； 张文娟； 徐雷；

【机构】 南方医科大学公共卫生与热带医学学院； 中山大学公共卫生学院；

【摘要】 目的运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人DNA聚合酶β基因在支气管上皮细胞（16HBE）中的表达,为后续研究NF-κBp65在环境化学污染物诱导细胞DNA损伤修复中的作用提供实验模型。方法:根据NF-κBp65的mRNA序列,结合文献,利用Ambion网上设计软件设计4条针对该基因不同靶点的siRNA干扰序列,通过T7体外转录系统转染入16HBE细胞,荧光定量PCR检测NF-κBp65mRNA。选择抑制效果最高的siRNA,构建NF-κBp65-shRNA的表达载体,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000^TM和siPORT^TMXP-1两种转染系统转染细胞,比较其抑制效果。选择抑制效率较高的转染系统,优化转染条件,从mRNA和蛋白至水平检测NF-κBp65抑制效果,从而建立最优的NF-κBp65的缺陷模型。结果:选择T7体外转录抑制效果做好的片段,构建NF-κBp65-shRNA的表达载体,发现采用si-PORT^TM XP-1转染系统的抑制率比脂质体Lipofectamine 2000TM高。优化转染条件,发现质粒浓度为0. 4ug,转染48h时NF-κBp65的mRNA抑制率较高,为62. 9%。Westernblot检测蛋白质表达水平下降了约60.2%。结论;RNAi技术可以有效的抑制16HBE细胞中NF-κBp65表达,该模型的建立有利于后续的实验的进行。更多还原