IRS6/Dok-5通过PKB/FOXO3a途径参与心肌细胞分化

【作者】 温见燕； 刘伟； 龚燕华； 柯元南； 强伯勤； 袁建刚； 彭小忠；

【机构】 中日友好医院全国中西医结合心血管病中心； 中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室；

【摘要】 <正>目的:胰岛素受体家族(IRS insulin-receptor substrate)在细胞生长、增殖和分化中发挥十分重要的作用。我们发现,IRS6/Dok-5(Docking protein)在心脏中高表达,P19CL6细胞中向心肌细胞分化过程中Dok-5 mRNA的表达水平明显增加,但是其表达调控的机制尚不明确。本研究的目的是揭示Dok-5基因在心肌细胞分化过程中的表达调控机制。方法:5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法确定Dok-5的转录起始位点;利用Dok-5上游启动子区5’端缺失体和突变体确定FHBE(Forkhead binding element)是否是参与Dok-5表达调控的重要元件;FOXO3a质粒与Dok-5启动子报告基因共转染P19CL6细胞后,观察荧光素酶报告基因活性的变化;免疫组化检测FOXO3a和Dok-5在心脏中的表达;电泳迁移率变动分析法(Electrophoretic mobilityshift assay EMSA)和染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation ChIP)研究FOXO3a与Dok-5启动子区的相互作用;通过siRNA方法观察FOXO3a和Dok5在心肌分化过程中的作用。结果:包含FHBE的序列明显抑制报告基因的表达;对该区域的FHBE进行突变,这种抑制作用就明显减弱,提示FHBE很可能是存在于Dok5启动子区中的负调控元件;EMSA实验证实核中分布的FOXO3a可以结合于Dok5上游的FHBE;ChIP实验进一步证实在未诱导的P19CL6细胞,FOXO3a可以结合到Dok5上游启动子区的FHBE,而DMSO诱导6 d和12 d的P19CL6细胞中FOXO3a不能结合Dok5的FHBE;过表达FOXO3a可以抑制Dok-5的启动子活性,同时FOXO3a从胞核转移到胞浆;FOXO3a的siRNA抑制FOXO3a的内源性表达,Dok-5 mRNA的表达水平增高并促进心肌细胞分化;Dok-5 siRNA可以减弱心肌细胞分化。结论:我们的结果首次发现PI3K/PKB下游的底物FOXO3a作为转录抑制因子抑制Dok-5的表达,Dok5通过PI3K/PKB/FOXO3a信号通路参与心肌细胞分化。更多还原