构建OECs-VEGF165基因工程细胞的实验研究

【作者】 屈传强； 陈裴； 郭洪志； 王翠兰； 杜怡峰；

【机构】 山东省立医院神经内科； 山东大学齐鲁医院神经内科；

【摘要】 目的:构建携带human-VEGF165基因的慢病毒载体,转染嗅鞘细胞(OECs),探索将human-VEGF165基因导入OECs的方法,分析构建OECs-VEGF基因工程细胞的可行性。方法:差速贴壁法纯化OECs,采用免疫荧光鉴定OECs原代细胞纯度。使用慢病毒包装试剂盒,通过三种质粒的共同转染293T细胞,合成携带目的基因的慢病毒载体。荧光实时定量PCR法测定病毒滴度,采用免疫荧光检测和ELISA检测OECs-VEGF165基因工程细胞。结果:差速贴壁法所取出的原代细胞约在所有细胞中占98%,第二代约占78%,第三代降至58%,活性也明显下降,细胞形态变得多种多样,增殖变缓。从质粒转染成功的293T细胞提取的蛋白中检测到22KD附近处有条带,其大小和目的基因合成的蛋白分子量相吻合。合成病毒的滴度为2×10~8个/ml。转染组GFP阳性细胞数占总细胞数的比例大于80%,转染后MOI为5亚组细胞死亡较少,细胞功能恢复快。转染成功的OECs观察到外源VEGFA的表达。结论:差速贴壁法纯化是简便、经济的体外研究OECs的方法,要选择合适的传代次数。通过携带有human-VEGF165基因的慢病毒载体感染OECs,构建出的human-NEGF-OECs基因工程细胞可稳定、高效表达VEGF165基因,合成的目的蛋白分泌到细胞外。更多还原