重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的分批培养

【作者】 陈保立； 葛鲁娜； 王世立； 韩金祥；

【机构】 山东省医药生物技术研究中心,国家卫生部生物技术药物重点实验室；

【摘要】 目的:骨形态发生蛋白-7(bone morphorgenetic protein,BMP-7)具有重要的成骨作用并且已用于临床治疗长骨骨不连,但目前国内外重组BMP-7的生产多见于哺乳动物细胞及昆虫细胞,虽活性较高但产量低、成本高,无法满足日益增长的科学研究和临床应用的需求,寻找高效表达具有成骨活性的重组BMP-7的方法,成为本领域的重要课题,本研究拟采用大肠杆菌表达系统,探索高效表达BMP-7成熟肽的新工艺。方法:1、适于表达rhBMP-7的pH值的确定:5%接种于含有100ml合成培养基的500ml摇瓶中,分别调pH为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4,30℃培养4h,42℃升温诱导3h,诱导前后分别取样进行SDS-PAGE凝胶电泳并分析目的蛋白占总蛋白的比例。2、适于rhBMP-7表达的诱导时间的确定:5%接种于含有100ml合成培养基的500ml摇瓶中,30℃培养4h,42℃升温诱导,分别诱导1h、2h、3h、4h、5h,诱导前后分别取样进行SDS-PAGE凝胶电泳并分析目的蛋白占总蛋白的比例。3、分批培养初始葡萄糖浓度的确定:配制培养基使初始糖浓度分别为15g/L、25g/L、35g/L、45g/L,10%接种,控制溶氧在20%以上,调节pH在7.0左右,每间隔1h取样测菌体密度(OD600)和葡萄糖残余量,当葡萄糖消耗殆尽时结束培养并根据测得的数据计算平均比生长速率。结果:1、培养基pH为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4时目的蛋白分别占总蛋白的10.9%、16.6%、19.8%、25.3%、28.0%。2、升温诱导1h、2h、3h、4h、5h后目的蛋白分别占总蛋白的18.5%、31.4%、33.4%、38.1%、34.3%。3、初始葡萄糖浓度为15g/L、25g/L、35g/L、45g/L的平均比生长速率分别为0.526、0.527、0.51、0.48。结论:初步建立了高效稳定的重组人骨形态发生蛋白-7工程菌分批培养的工艺,即10%接种于初始糖浓度为25g/L的合成培养基中,30℃培养4.5h,pH控制在7.0左右,42℃升温诱导并调pH至7.4培养4h下罐。经验证工程菌菌体密度干重可达7g/L(OD600=15),rhBMP-7成熟肽占总蛋白的30%。更多还原