【作者】 谭晓秋； 陈桂兰； 杨艳； Isao Inoue； 曾晓荣；

【Author】 Isao Inoue

【机构】 医学电生理四川省重点实验室泸州医学院心肌电生理学研究室；

【摘要】 目的:小电导钙激活钾通道是近年来在心肌组织发现的离子通道,参与了心肌细胞复极化过程,同时在胞内钙离子调控中起重要作用。本研究拟克隆人心房肌小电导钙激活钾通道(SK2),并构建稳定表达SK2通道的HEK293细胞系并鉴定,为进一步研究通道功能活动提供基础。方法:以人心房肌为标本,通过总RNA提取和逆转录得到cDNA,设计3对引物,进行重叠PCR法和定向克隆构建真核表达载体pIRES-hrGFP-SK2和pEF1-SK2。经过测序验证之后,采用脂质体法转染至HEK293细胞并筛选稳定表达的细胞系;采用Western-blot和免疫荧光鉴定蛋白表达,全细胞膜片钳技术进行电流记录。结果:构建的表达质粒经酶切反应得到目的片段位置正确;质粒测序结果与GenBank数据库一致;Western Blot结果显示目的条带位置与预测值一致;免疫荧光共聚焦实验显示在HEK293细胞中存在SK2通道表达,证明转染成功。膜片钳实验记录到明显内向整流特性的电流,并具有明显的胞内钙离子依赖性。结论:成功构建稳定表达人心房肌SK通道的HEK293细胞系,并通过多种方法鉴定表达成功,为以后研究通道功能活动奠定了基础。更多还原