【作者】 闫竹青； 金艳燕； 吕琼； 杨予涛； 张进禄； 徐志卿；

【机构】 首都医科大学神经生物学系北京神经科学研究所北京神经再生修复研究重点实验室；

【摘要】 甘丙肽是一种含有二十九个氨基酸的神经肽,广泛分布于中枢神经系统和外周组织中,参与多种重要的生理和病理功能。目前已经克隆出三种甘丙肽受体,甘丙肽1型受体（GalR1）、甘丙肽2型受体（GalR2）和甘丙肽3型受体（GalR3）,均为G蛋白偶联受体。本实验构建了带mRFP标签的β-arrestin真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞上,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。GalR2-EGFP主要分布在细胞膜上,少量分布于胞浆中,而β-arrestin-mRFP则只见于胞浆中。给予甘丙肽(10^-7mol/L)刺激后,原本在胞浆中分布的β-arrestin在近膜处聚积,与GalR2-EGFP有共定位,随着时间的延长,受体内在化,并仍与β-arrestin共定位。用免疫荧光组化标记内源性β-arrestin,在稳定表达EGFP标记的GalR2融合蛋白的PC12细胞上,共聚焦显微镜下可以看到同样的现象。那么受体入胞后是否进入早期内涵体呢?将特异性定位于早期内涵体的蛋白EEA1进行免疫荧光标记,可以看到,受体入胞后与EEA1存在明显的共定位。然后选择较特异性定位于晚期内涵体的rab7进行标记,可以看到,给予刺激后,受体在胞内与rab7存在明显的共定位,且随着时间的延长共定位更加明显。本实验得出如下结论:配体激活后的GalR2与β-arrestin相互作用,共同内在化;内化后的GalR2转运到早期和晚期内涵体中。更多还原