大肠杆菌胁迫下东北林蛙皮肤活性肽的特异性表达

【作者】 徐佳佳； 肖向红； 苗慧敏； 柴龙会； 杨淑静；

【机构】 东北林业大学生理教研室；

【摘要】 本研究以东北地区两栖类优势物种东北林蛙（rana dowbyskii）为试验对象,用大肠杆菌作为环境胁迫因子观察其皮肤活性肽谱的特异性表达,以期揭示两栖类动物抵御环境微生物的皮肤活性肽变化规律。将东北林蛙100只随机分为大肠杆菌胁迫组（对数期E.coli,ATCC 25922）和对照组（无菌LB培养液）,采用温和电刺激（6V,30s）东北林蛙背部皮肤腺,收集浸浴1h后置入暴气24h水环境后第1、3、5、7、10、13、18、23、27、30天和处理前的皮肤分泌物,经Sep-Pak C₁₈固相萃取、RP-HPLC分离纯化获得各个时段其皮肤分泌物的RP-HPLC肽谱,将处理前的肽谱作为基础肽谱。优化了RP-HPLC条件,线性梯度洗脱:流动相为0.1%TFA水和0.1%TFA乙腈,后者在0-70min内由20%上升至50%,流速为0.5mL/min,紫外检测波长为216nm,获得重现性良好的稳定肽谱。RP-HPLC显示其基础肽谱中可获得22个峰形良好的色谱峰。大肠杆菌胁迫后各时间段的HPLC图谱比较,洗脱时间为28.77,30.33,34.80,40.37min的4个色谱峰在胁迫后的第1～30天内均有表达,与基础肽谱比较其峰面积值恢复了218.64%,94.05%,117.95%,25.35%;洗脱时间为45.6min的色谱峰是胁迫后第1～27天时间段出现的特异峰,暂名为dowbyskii-A;洗脱时间为17.58、32.87、37.70、50.14、59.32min的5个色谱峰在大肠杆菌胁迫后第7天呈一过性特异出现,暂名为dowbyskii-B、C、D、E、F;在对照组第18天一过性出现与大肠杆菌胁迫组第7天相对应的6个色谱峰;基础肽谱中其他色谱峰胁迫后未出现。以上结果显示,两栖类皮肤在进化过程中逐渐形成了以抗微生物活性肽为重要组成的先天免疫屏障机制,微生物胁迫可引发皮肤活性肽的选择性表达。更多还原