【作者】 张安红； 王志安； 肖娟丽； 罗晓丽；

【机构】 山西省农业科学院棉花研究所；

【摘要】 WRKY是一类主要存在于植物中的转录因子超家族。自Ishiguro和Nakamura从甘薯中分离到SPF1后,WRKY便开始得到广泛的研究和关注,WRKY转录因子在植物应对冻害、干旱、盐害等非生物胁迫与病原菌虫害等生物胁迫反应中起着重要的调控功能。根据同源蛋白设计简并引物,用RACE和RT-PCR的方法从陆地棉中克隆得到一个新的WRKY基因,即GhWRKY5。该基因全长为1205bp,其中ORF为875bp,共编码302个氨基酸。利用半定量RT-PCR分析了GHWRKY5在棉花不同组织中及不同非生物胁迫下的表达情况。结果表明:GHWRKY5在棉花根、茎、叶中均有表达。在盐胁迫下,GHWRKY5表达有不同程度的增加,说明非生物胁迫下GHWRKY5在棉花抗逆中可能发挥重要作用。利用植物表达载体pBI121作为骨架,将棉花GHWRKY5基因引入,构建成植物表达基因pBWRKY5,该基因由组成型表达启动子CaMV35S驱动。通过农杆菌介导法转化烟草,共获得85个转基因再生株。利用PCR初步筛查,共获得62株转基因PCR阳性株,转化再生植株PCR检测结果阳性率为72.5%。从中选出6棵阳性转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交检测,结果显示转基因植株与阳性对照一样有特异性条带,而非转基因对照植株没有这条特异性条带。通过RT-PCR进一步验证外源基因在再生植株中的表达情况,RT-PCR的检测结果证明转基因烟草中GHWRKY5基因在mRNA水平上能正常表达。但是不同的转基因个体GHWRKY5基因的表达量不同。对3个株系的PCR阳性植株进行抗菌性检测,以未转基因烟草作为对照。分别在接菌48h和56h后取烟草叶片进行检测。虽然各个株系的抗性大小不一,但是转基因株系的抗性明显高于对照株。这可能是由于外源基因在植物体内表达差异引起的。对转基因烟草进行盐胁迫处理,结果显示转基因烟草株系具有较高的抗盐性,并且在盐胁迫下转基因烟草保持较高水平的叶绿素含量。分子生物学检测和对Pt1528的抗菌性检测以及对转基因烟草的盐胁迫处理结果,都表明在转基因烟草中,转录因子GHWRKY5基因高效表达。它参与生物和非生物胁迫信号的传导,并调控它下游的抗性基因的表达,提高了转基因烟草的抗逆性。这为构建高效抗逆性转基因作物提供了可靠的实验依据。更多还原