尿卟啉原Ⅲ合成酶(UROS)基因的克隆与原核表达

【作者】 李存保； 王美玲；

【机构】 内蒙古医学院；

【摘要】 目的:获得UROS在大肠杆菌中的高效重组表达重组蛋白,并纯化至均一,为UROS结构及功能的研究提供基础。方法:本实验利用RT-PCR方法,以人肝脏组织总RNA的反转录cDNA为模板,参照UROS cDNA的编码序列,设计合成正反向两条引物,进行UROS cDNA的扩增,并构建pET30a(+)-UROS重组质粒。把含有外源片段的pET30a(+)-UROS重组质粒转入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,经镍柱一步纯化获得高纯度的His6-UROS融合蛋白。结果:1、以人肝脏组织总RNA的反转录cDNA为模板,参照UROS cDNA的5’和3’端序列,设计合成两条引物,采用PCR扩增出大小约750bp的特异DNA片段,进一步测序表明同已公布的UROScDNA序列完全相同;2、成功构建了pET30a(+)-UROS融合表达载体,融合表达的蛋白在N端具有六个组氨酸标签,便于后续纯化、鉴定;3、pET30a(+)-UROS融合表达载体转入BL21进行诱导表达后,通过SDS-PAGE分析表明,融合表达的蛋白分子量约为29kDa,并且该蛋白质有小部分表达于上清,这为下一步纯化和获得有活性的蛋白质进行体外实验带来了便利;4、带有His-Tag的融合蛋白经镍柱一步纯化后,进行常规Western blot鉴定,杂交到了特异的条带,表明利用His-Tag筛选和纯化目的蛋白是一种快速而有效的方法。结论:本实验成功地克隆出编码成熟UROS的基因片段,并构建了高效原核融合表达载体:pET30a(+)-UROS。获得了UROS在大肠杆菌中的高效重组表达重组蛋白,并纯化至均一,为UROS结构和功能的研究提供了基础。更多还原