靶向Pim-3的shRNA载体的构建及其对小鼠肝癌的治疗作用

【作者】 郭切； 兰培祥； 张建； 田志刚； 张彩；

【机构】 山东大学药学院免疫药理与免疫治疗研究所；

【摘要】 背景/目的:Pim-3是Pim家族中的一员,这种原癌基因主要通过磷酸化一些促凋亡蛋白(如Bad)使其失活,从而抑制肿瘤细胞的凋亡,导致肿瘤的发生发展。目前关于它的研究主要集中在造血系统及消化系统的一些肿瘤,但有关Pim-3和肝癌的报道并不多。基于上述背景,本研究针对肝癌靶基因Pim-3,设计并构建靶向Pim-3基因的shRNA表达载体,在体外观察Pim-3-shRNA的沉默作用及对肝癌细胞系凋亡、增殖等生物学特性的影响;同时以C57BL/6小鼠进行皮下荷瘤,注射沉默Pim-3基因的shRNA质粒后,观察其对于肿瘤的治疗情况。方法:以小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6和H22为主要研究对象,首先分别检测Pim-3在上述两种小鼠肝癌细胞系和正常的小鼠肝细胞中表达的差异;继而用沉默Pim-3的shRNA质粒转染肝癌细胞系,24h后,通过 Real-time PCR和Western-blot技术分别从基因水平和蛋白水平检测上述质粒对于Pim-3的沉默作用;通过AnnexinⅤ/PI染色和TUNEL技术检测肝癌细胞凋亡的变化,同时检测Bad、p-Bad、BCL-2、BCL-XL等凋亡相关分子以及凋亡信号通路中caspase-8表达的变化;进一步观察小鼠脾淋巴细胞对于上述两种肝癌细胞系杀伤活性的变化。在体内试验中,主要通过用Hepa1-6和H22分别对C57BL/6和Balb/c小鼠进行皮下荷瘤,观察注射Pim-3-shRNA后,对小鼠肿瘤生长以及生存期的影响。结果:Pim-3在正常的小鼠肝组织和肝细胞系表达极低,而在肝癌细胞系明显高表达;用Pim-3-shRNA质粒分别转染Hepa1-6和H22细胞系可明显降低Pim-3基因和蛋白水平的表达;凋亡相关分子P-Bad、BCL-2、BCL-X明显下调,caspase-8的表达明显增加,并明显促进肝癌细胞的凋亡。对C57BL/6小鼠进行皮下荷瘤2周,再瘤内注射Pim-3-shRNA 2周后,发现Pim-3-shRNA治疗可以显著抑制肿瘤的生长。结论:靶向Pim-3的shRNA载体可以明显促进肝癌细胞的凋亡、抑制增殖,并增强其对免疫细胞杀伤的敏感性。靶向Pim-3的 RNA沉默技术有望成为新的用于肝癌等肿瘤治疗的新策略。更多还原