重组人单链IL-23的构建、表达及生物学活性的鉴定

【作者】 张英； 齐文娟； 洛江坤； 陈勇； 方强；

【机构】 蚌埠医学院免疫教研室； 安徽省感染与免疫重点实验室； 蚌埠医学院病原生物学教研室；

【摘要】 研究背景:IL-23作为IL-12家族的重要成员,在激活和调节针对抗原特异性T细胞免疫的反应作用较IL-12更有效、且不会诱导淋巴细胞产生过多的IFN-γ,从而减少了毒性,有作为疫苗佐剂提高免疫保护效果的潜力。由于IL-23结构复杂,只有两个亚基呈异二聚体表达时才具备生物学功能,通过15个氨基酸多肽连接p40和p19两个亚基,体外构建重组人单链IL-23融合基因,并真核表达具有生物学活性的重组人单链IL-23(hsc IL-23),可为探讨hsc IL-23作为疫苗佐剂的研究及后期应用奠定基础。目的:构建hsc IL-23融合基因,真核表达hsc IL-23重组蛋白并鉴定其生物学活性。方法:应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头(linker)(Gly4Ser)3串联IL-23 p40和p19亚基基因,构建hsc IL-23融合基因,经测序鉴定后装载入真核表达质粒pc DNA3.1(+),并进行酶切、测序鉴定;pc DNA3.1(+)-hsc IL-23质粒转染He La细胞,同时设转染pc DNA3.1(+)质粒组和未转染质粒组,转染48h后分别收集细胞及细胞培养上清。以人IL-23 ELISA试剂盒鉴定各组细胞培养上清中hsc IL-23融合蛋白的含量,通过与标准品比对,测定各组细胞培养上清中hsc IL-23的表达水平。分离人PBMCs,加入收集的各组细胞培养上清及PHA-P共培养72 h,MTT法检测各组人淋巴细胞的增殖水平。结果:构建的pc DNA3.1(+)-hsc IL-23表达质粒经测序鉴定,插入片段序列与预期完全一致。转染各组质粒的He La细胞中,ELISA检测He La细胞在转染质粒48h后培养上清液中hsc IL-23蛋白的含量,其中未转染组细胞培养上清为9.11±11.78pg/ml,转染pc DNA3.1(+)组的含量为10.47±9.04pg/ml,而转染pc DNA3.1(+)-psc IL-12组为254.34±2.77 pg/ml,显著高于前两组(P<0.01)。通过MTT法检测各组细胞培养上清刺激人淋巴细胞的增殖结果,未转染质粒组在570nm处的吸光度为0.553±0.038,PHA-P刺激组(阳性对照组)为1.968±0.018,转染pc DNA3.1(+)组为0.595±0.289,转染pc DNA3.1(+)-hsc IL-23组为1.135±0.048,显著高于未转染质粒组和转染pc DNA3.1(+)组(P<0.01)。结论:成功构建了hsc IL-23融合基因,并真核表达了具有生物学活性的hsc IL-23重组蛋白。更多还原