治疗性双功能表达载体通过纠正肝细胞内源性免疫耐受逆转机体系统性免疫耐受

【作者】 兰培祥； 张彩； 韩秋菊； 张建； 田志刚；

【机构】 山东大学药学院免疫药理与免疫治疗研究所；

【摘要】 背景/目的:在HBV慢性感染过程中,HBV进入肝脏实质细胞之后,能够抑制肝细胞中的天然识别受体和Ⅰ型IFN信号通路从而抑制肝脏内源性抗病毒应答。同时,HBV慢性感染能够引起T细胞耗竭和对HBV抗原无应答,导致机体系统性免疫耐受,这给抗HBV治疗带来了巨大的挑战。因此,研究HBV诱导的免疫耐受机制及逆转免疫耐受成为抑制HBV复制、彻底清除HBV的关键。方法:我们成功构建了一种兼具免疫激活作用和靶向沉默HBx基因的shRNA双功能表达载体,采用高压注射的方式对HBV慢性感染小鼠进行体内治疗。2周后,通过PCR检测HBV DNA及 RNA的含量及免疫组化方法检测肝脏组织中HBV抗原的表达。观察该双表达载体对HBV的抑制和清除能力;为了检测HBV阳性小鼠中的肝脏内源性免疫和系统性免疫的活化情况,分别检测肝脏细胞中的信号通路分子和肝脏CD8+T细胞的活化状况。并通过细胞清除和过继转输实验来进一步证实在清除HBV过程中发挥重要作用的免疫细胞。最后,通过受体阻断实验和TLR7干预实验,证实Ⅰ型IFN和TLR7在双表达载体清除HBV过程中的作用。结果:在HBV阳性小鼠模型中,肝实质细胞内的Ⅰ型IFN信号通路受到抑制,存在着肝细胞内源性免疫耐受;同时肝脏组织中的CD8+T细胞表面免疫抑制性分子PD-1表达上调,细胞的活化和功能受到明显抑制。利用双表达载体进行治疗之后,一方面,HBV的复制和表达受到明显抑制,表现为HBV DNA含量下降,HBs和HBe抗原表达明显减少;另一方面,双表达载体可通过激活肝细胞内TLR7信号通路,刺激I型干扰素和抗病毒蛋白的表达,逆转肝脏细胞的内源性免疫耐受。同时,TLR7活化所诱导分泌的大量Ⅰ型IFN,可进一步激活CD8+T细胞,并促进anti-Hbs Ab的产生,解除HBV诱导的获得性免疫耐受。进一步通过细胞清除和转输实验证实,CD8+T细胞及其产生的IFN-γ在双表达载体促进HBV清除的过程中发挥了关键作用。结论:靶向HBx的具有免疫刺激作用的双功能表达载体能够解除HBV对肝脏细胞内源性免疫的抑制,进而逆转机体的获得性免疫耐受,从而实现对HBV的清除。更多还原