LPS诱发的点带石斑鱼免疫相关基因鉴定、克隆与组织表达差异性分析

【作者】 徐先栋； 吴学贵； 谢珍玉； 王世锋； 周永灿；

【机构】 海南大学海洋学院； 江西省水产科学研究所； 海南大学海洋生物实验教学示范中心； 海南大学海南省热带水生生物技术重点实验室；

【摘要】 本研究首先以热酚水抽提法提取致病溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)强毒株HN08155和弱毒株HN08152的粗脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS);以弱毒株HN08152和大肠杆菌(Escherichia coli)LPS作对照,将不同浓度的溶藻弧菌强毒株HN08155粗LPS通过腹腔注射法接种点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus),通过测定死亡率和各组石斑鱼血液中白细胞吞噬活性、血清抗菌活性、溶菌活性和酚氧化酶活性等免疫指标,研究该LPS对点带石斑鱼的毒性和免疫保护力。结果表明,溶藻弧菌强毒株和弱毒株粗LPS均对石斑鱼具有比较强的毒性,溶藻弧菌LPS对石斑鱼的免疫保护力随LPS浓度的增高而增强,高纯度的大肠杆菌LPS对石斑鱼的免疫保护效果要优于溶藻弧菌粗LPS。选用大肠杆菌标准菌株(E.coli 055:B5)LPS刺激的石斑鱼头肾细胞cDNA为Tester组,注射PBS的对照组石斑鱼头肾细胞cDNA为Driver组,进行抑制差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH),构建cDNA文库。对阳性克隆进行测序并经生物信息学分析,共获得16种不同功能基因的克隆。其中免疫相关功能基因热休克蛋白70(HSP70)、免疫球蛋白重链(Ig H)、干扰素调节因子-2(irf2)、T-Complex protein 1-theta(tcp-1-theta)、40S核糖体蛋白S8(rpS8)和空泡蛋白分选(vps8)基因共6种,代谢功能基因β肌动蛋白(β-actin)及ct054蛋白2种,氧运输功能基因血红素-α链(alpha-chain Hb)、血红素-β链(beta-chain Hb)和铁蛋白重链(fhc)3种;转录、翻译调节功能基因有蛋白质翻译延伸因子-2(Eef2)和胶原蛋白C的内肽酶增强子(pcpe)2种;其他功能基因有骨髓白细胞分化蛋白家族(Myeloid leukemia differentiation protein homologue)基因、斑马鱼基因库中编号为73290基因(zgc:73290)和未命名蛋白基因3种。应用实时定量PCR技术研究了LPS刺激点带石斑鱼后HSP70和Ig H基因在石斑鱼头肾、心脏、脾脏、肝脏、鳃及肠系膜6个组织中前后表达的差异性,此外还克隆出了β-actin基因的全长cDNA序列,研究了其在点带石斑鱼中的特异性表达。更多还原