酵母双杂交系统筛选人肝脏cDNA文库中与肝吸虫PLA2相互作用蛋白的基因序列

【作者】 李晔； 李兆蕾； 尚梅； 吴银娟； 毛强； 黄艳； 贾飞飞； 简煜； 李妍； 单士超； 余新炳； 李学荣；

【机构】 中山大学中山医学院寄生虫学教研室；

【摘要】 目的本实验室先前研究证实华支睾吸虫分泌排泄产物(CsESP)重要成分之一分泌型磷脂酶A2(CsPLA2)能引起宿主肝星状细胞的活化增殖,其活化增殖的作用不是通过CsPLA2的酶活性而是通过结合宿主细胞表面相关受体实现的。本实验选取了华支睾吸虫CsPLA2作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交技术,以筛选人肝脏细胞上与CsPLA2相互作用的受体蛋白质分子,进一步明确CsPLA2在肝吸虫致肝纤维化过程中的作用机制。方法 PCR扩增CsPLA2基因,将其克隆入诱饵载体pGBKT7-CsPLA2,测序验证后再转化入酵母Y2HGold中,涂布于SD/-Trp、SD/X-α-gel、SD/X-α-gel/AbA、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade等缺陷培养平板上,观察生长情况,并进行诱饵蛋白CsPLA2的毒性测试及自身激活活性测试,直接提取转入pGBKT7-CsPLA2的酵母菌总蛋白,进行Western blottig,验证诱饵蛋白有无表达。验证后用含诱饵载体pGBKT7-CsPLA2的酵母Y2HGold与含人肝文库cDNA载体(pGADT7)的酵母Y187进行杂交(mating)。杂交后产物涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷培养平板上,培养7-14天后生长出的菌落再扩大培养,提取酵母菌落质粒进行PCR,对PCR产物进行测序,测序所得序列经BLAST、亚细胞定位分析等鉴定。将CsPLA2及筛选获得序列片段分别克隆到载体pEGFP-C1、pcDNA6/myc/his上,再分别单独转染及共转染293T细胞,细胞裂解液利用抗CsPLA2抗体进行免疫共沉淀(COIP)反应。结果 Western blotting显示诱饵蛋白CsPLA2可在酵母Y2HGold中表达,且对酵母细胞毒性较小,无自身转录激活活性,因而可以通过酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质。杂交后产物在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷培养平板上共筛选获得7个阳性菌落,其中有5个菌落成功扩大培养,提取这5个菌落质粒后进行PCR扩增,PCR扩增产物进行序列测定及BLAST分析后,显示这些基因分别为metallothionein-2(金属硫蛋白-2)、aminoacylase-1(氨基酰化酶-1)、cytochrome c oxidase subunit I(化酶次单元-1)、hemopexin(促血红素结合蛋白)及transmembrane 7 superfamily member 3 precursor(tm7sf3),通过亚细胞定位预测排除定位于线粒体等的蛋白质,最终获得了各属于hemopexin及transmembrane 7 superfamily member 3 precursor(tm7sf3)的两段基因序列。免疫共沉淀(COIP)的结果同样证实了蛋白质CsPLA2能与人肝细胞蛋白hemopexin、tm7sf3相互作用。结论本实验利用酵母双杂交筛选出了人肝脏细胞上可能存在的与CsPLA2相互作用的蛋白质hemopexin、tm7sf3,通过COIP在体外进一步验证了CsPLA2能与hemopexin、tm7sf3相互作用。酵母双杂交和免疫共沉淀分别从体内和体外验证了CsPLA2与人肝细胞hemopexin、tm7sf3具有相互作用,为进一步研究CsPLA2是通过何种信号通路引起HSC活化增殖提供了重要基础。更多还原