弓形虫联合重组诊断抗原的克隆与表达

【作者】 李瑾； 魏庆宽； 肖婷； 王卫艳； 徐超； 刘功振； 黄炳成；

【机构】 山东省医学科学院,山东省寄生虫病防治研究所；

【摘要】 目的刚地弓形虫是一种世界性分布的感染率很高的专性胞内寄生虫,对于免疫力正常的人一般为隐性感染,而妊娠初期或免疫能力低下者,往往表现严重的弓形虫病。弓形虫的诊断对于控制弓形虫感染有重要意义,而其免疫学诊断的敏感性和特异性主要取决于诊断抗原,为此进行了联合重组抗原的基因克隆和表达,为弓形虫诊断奠定基础。方法首先利用生物信息学技术对弓形虫ROP2、SAG1、SAG2、GRA6、GRA7基因进行分析,选取适宜的片段作为目的基因片段,根据目的基因及载体核酸序列设计引物。复苏液氮保存的弓形虫RH株速殖子,腹腔接种小鼠,收集速殖子,提取弓形虫基因组DNA。以提取的弓形虫基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为50μL;反应条件为95℃预变性4 min,94℃变性45 sec,56℃复性45 sec,72℃延伸1 min,共35个循环,最后72℃延伸7 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,通过凝胶回收试剂盒进行纯化回收。对PCR产物及载体pGEX-4T分别进行双酶切,将双酶切获得的目的基因及pGEX-4T片段通过PCR产物回收试剂盒进行回收,将获取的目的片段与载体连接,连接产物经热冲击法转化入E.coli TOP10感受态细胞。氨苄青霉素LB平板初筛,挑取转化后平板上的单菌落于试管中,培养过夜,抽提质粒,采用双酶切鉴定,并将重组质粒送测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒转化表达菌株BL21(DE3),获得单菌落平板。挑取单菌落于试管中,过夜培养。将培养的菌液按1:100比例接种于含氨苄青霉素的LB培养基中,扩大培养。当OD值达到0.6-0.8左右时,添加IPTG进行诱导。收集菌体于冰浴中超声破碎菌体。超声完毕,离心后上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析。结果应用PCR方法扩增的ROP2、SAG1、SAG2、GRA6、GRA7基因片段分别进行琼脂糖凝胶电泳,电泳显示,在相应位置出现明显的条带,均与目的片段大小一致,表明目的片段成功获得了扩增;各重组质粒经双酶切,电泳显示在相应位置均出现条带,其大小均与理论预测值一致,表明获得了正确的重组质粒;用Sanger末端终止法对插入的目的基因进行序列测定,并与已知相应基因序列进行比较,发现100%同源;阳性重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定。经IPTG诱导后,出现一条特异性蛋白带。重组抗原均以融合蛋白的形式进行表达,pGEX-4T载体表达的GST蛋白为26 KD,表达的ROP2、SAG1、SAG2、GRA6、GRA7大小分别为38 KD、26KD、21KD、26KD、27KD与理论预测值相符。结论成功构建了弓形虫联合重组抗原原核表达载体并进行了正确表达,为下一步弓形虫病的诊断奠定了基础。更多还原