华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白基因的克隆、表达与免疫学功能的初步研究

【作者】 边萌； 余新炳；

【机构】 中山大学基础医学院寄生虫学教研室；

【摘要】 目的对基因组中华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白CsNOSIP进行克隆、原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能和免疫小鼠后抗体亚类和细胞因子的变化及诱发宿主免疫应答类型。方法应用生物信息学分析软件,分析CsNOSIP的序列特点和基本理化特征;将CsNOSIP基因克隆到原核表达质粒pET-30a(+)中,诱导表达并用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用纯化的CsNOSIP蛋白免疫BABL/c小鼠获得免疫血清;用Western blot进行ESP的双向识别及免疫原性、免疫反应性分析;应用免疫荧光方法观察CsNOSIP在华支睾吸虫成虫的定位;应用ELISA检测实验组(重组蛋白皮下免疫小鼠)和对照组(PBS免疫小鼠)抗体亚类和细胞因子水平的变化。结果 CsNOSIP的基因序列全长为867bp,编码289个氨基酸,具有与eNOS相互的功能位点;Target P和Secretome P分析显示CsNOSIP为通过非经典途径分泌排泄的蛋白;PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-30a(+)-CsNOSIP重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中获得高效表达,分子量为35 kDa;经亲和层析获得了高纯度蛋白;重组蛋白可被ESP血清识别,ESP蛋白可以被CsNOSIP免疫血清识别,重组蛋白亦可被其免疫的BABL/c小鼠血清、感染了华支睾吸虫的BABL/c小鼠血清识别;CsNOSIP主要定位于虫体的肠支、卵黄腺和虫卵;ELISA结果表明实验组小鼠血清中IgG1水平明显高于对照组,与对照组相比,实验组脾细胞培养上清中IL-4和IL-6水平明显高于对照组。结论 CsNOSIP基因与多个物种同源,编码蛋白可能是华支睾吸虫重要的虫体分泌排泄抗原成分,具有免疫原性和免疫反应性,可诱发宿主发生Th2免疫反应。更多还原