杜氏利什曼原虫rAST1蛋白的构建及黑热病诊断的初步研究

【作者】 陈建平； 陈宪； 张建国； 徐佳楠； 陈达丽；

【机构】 四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫学教研室； 四川大学基础医学与法医学院形态学实验室；

【摘要】 目的内脏利什曼病(visceral leishmaniasis,VL)又称黑热病(kala-azar),在世界范围内广泛流行,波及62个国家,约2亿人受到本病的威胁,每年估计新增病例约50万人。每年估计新增病例50万人。黑热病曾广泛分布于我国长江以北16个省、市、自治区,自1950年代经大规模的有效防治,多数地区已基本消灭了黑热病,但在新疆、甘肃、四川、陕西、山西和内蒙古等6省(区)仍有当地感染的新病例发生。特别是"512汶川大地震"的重灾区四川汶川、北川、青川、茂县、安县、平武和甘肃文县等县均为黑热病流行区,由于地震导致灾区人民生活生产设施破坏,保虫宿主犬到流窜,传播媒介吸血白蛉孳生环境扩大,再加上抗震救灾外来人群剧增,因此中国地震地区出现黑热病流行可能性极大。黑热病确诊依赖于在淋巴结、骨髓或脾等穿刺物涂片上查见利什曼原虫无鞭毛体,这种方法不仅会给病人造成痛苦,而且由于原虫的检出率较低,临床易产生漏诊。目前多种血清学方法应用于利什曼病的诊断,包括直接凝集实验(DAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。这些方法各有利弊。发展高效、快速、敏感的诊断方法依然是黑热病研究的一个重点。方法以杜氏利什曼原虫L.d.GS的基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得amastni基因扩增产物。将amastin基因定向克隆到pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-GSamastin。amastin基因经测序,同源性分析,并对其跨膜区结构进行分析。用PCR方法扩增得到amastin基因N端第一个胞外区序列(命名为ast1),并将其定向克隆到质粒pET32a(+)上,成功构建了原核重组表达质粒pET32a(+)-ast1。重组蛋白rAST1在大肠杆菌中高效表达,并用固定化金属离子亲和层析(IMAC)法进行纯化。以重组蛋白rAST1作为包被抗原,用ELISA的方法检测内脏利什曼病人血清。结果所得amastin基因经测序,同源性分析表明与L.d.SC10H2的同源性最高,核苷酸序列同源性为99.6%,氨基酸为98.8%;而与来自L.major和L.infantium的无鞭毛体蛋白基因序列的同源性最低核苷酸序列同源性仅为7.8%-26.6%,氨基酸序列为19.4-23.4。跨膜区预测结果显示所得到的无鞭毛体蛋白有四个跨膜区域,依次位于N端的第1(2)～20aa,72(74)～94(95)aa,101(102)～121(124)aa,161(165)～182(183)aa。N端胞外区有一个11个aa的高度保守序列amastinsignature(-CVTVWGLKNDC-)。两端的2个半胱氨酸,中间的1个甘氨酸、1个色氨酸和1个苏氨酸的保守位点与其它无鞭毛体蛋白家族成员完全一致。用PCR方法扩增得到amastin基因N端第一个胞外区序列(命名为ast1),并将其定向克隆到质粒pET32a(+)上,成功构建了原核重组表达质粒pET32a(+)-ast1。重组蛋白rAST1在大肠杆菌中高效表达,并用固定化金属离子亲和层析(IMAC)法进行纯化。以重组蛋白rAST1作为包被抗原,用ELISA的方法检测内脏利什曼病人血清,结果发现阳性率为90%;用杜氏利什曼原虫前鞭毛体可溶性抗原(SLA)做包被抗原检测,阳性率为100%。结论 rAST1可作为诊断内脏利什曼病的候选抗原多肽。更多还原