中国野生华东葡萄抗白粉病泛素连接酶基因的功能鉴定

【作者】 杨亚州； 代玲敏； 马福利； 姚文孔； 王杰； 王磊； 樊荣； 王跃进；

【机构】 西北农林科技大学园艺学院；

【摘要】 中国野生华东葡萄株系(Vitis pseudoreticulata)‘白河-35-1’对葡萄白粉病具有很强的抗性。泛素连接酶E3能识别特定的靶蛋白并对其进行泛素化修饰,是蛋白泛素化修饰过程的关键酶,在植物的生长发育、逆境响应及抗病过程中起重要作用。克隆和鉴定抗白粉病相关的泛素连接酶基因对阐明中国野生华东葡萄抗白粉病的机制和抗病育种有重要意义。首先将前期构建的华东葡萄‘白河-35-1’株系的抗白粉病cDNA文库中的所有EST序列与植物泛素连接酶基因数据库plantsUPS中的序列进行比对,筛选出泛素连接酶基因序列。通过实时荧光定量PCR的方法,分析白粉菌诱导条件下泛素连接酶基因在抗病植株‘白河-35-1’和感病的欧洲葡萄品种‘黑比诺’中的表达差异,筛选出抗病植株特异表达的泛素连接酶基因VpUU3,并从‘白河-35-1’中克隆该泛素连接酶基因的全长序列。构建诱饵表达载体,利用Clontech公司的GAL4-Two-Hybrid System 3酵母双杂交系统的筛选泛素连接酶VpUU3的靶蛋白。用泛素连接酶基因VpUU3置换pCAMBIA2301中的GUS基因,构建VpUU3基因的过量表达载体。通过农杆菌介导法分别转入模式植物拟南芥和欧洲葡萄品种‘红地球’。通过PCR和Southern blot的方法对转基因植株进行鉴定,通过分析转基因植株的表型鉴定该泛素连接酶基因的抗病功能。华东葡萄‘白河-35-1’株系的抗白粉病cDNA文库包含1 727条非冗余序列,将其与plantsUPS中的泛素连接酶基因进行比对,共鉴定出20条泛素连接酶基因序列。其中,14条为RJNG型泛素连接酶,5条为F-box型泛素连接酶,1条为U-box型泛素连接酶。实时荧光定量PCR分析表明,泛素连接酶基因VpUU3受白粉菌接种和外源水杨酸诱导表达。酵母双杂交筛选结果表明,泛素连接酶基因VpUU3与DAHP合成酶互作。对获得的35株转基因葡萄植株的表型鉴定表明,其中31株的叶片上出现畸形凹陷或坏死斑,进一步观察表明叶片坏死部位无病原菌。DAB染色表明叶片的坏死部位过氧化氢大量积累。转化VpUU3的拟南芥植株叶片上未见异常,且转基因植株与野生型对白粉病的抗性无明显差异,说明该基因具有物种特异性。物种间该泛素连接酶的序列差异较大可能是拟南芥植株异源表达未产生过敏性坏死的原因。综合以上结果表明,华东葡萄泛素连接酶VpUU3可能是通过调节抗病过程中的过敏性而起到抗病作用。而DAHP合成酶在VpUU3诱导的过敏性反应中的作用仍在研究中。更多还原