基于RNA干扰的抗粗缩病转基因玉米培育

【作者】 王平安； 吴连成； 杨艳坤； 祖小峰； 陈彦惠；

【机构】 河南农业大学农学院； 郑州大学生物工程系；

【摘要】 玉米粗缩病是一种在中国及世界玉米产区普遍发生的病毒性病害。目前的农艺措施和化学药剂控制不能有效的防治玉米粗缩病,选育抗病品种才是最根本的途径。然而,当前的育种材料中,抗粗缩病种质资源有限,仅仅靠常规育种很难满足培育抗病品种的需求。本研究根据RNA干扰原理,将人工合成的玉米粗缩病毒干扰片段构建成RNA干扰载体,以玉米HiII幼胚为受体材料,利用农杆菌介导法将干扰基因转化到玉米基因组中,通过除草剂表型筛选、标记基因PCR检测、目的基因PCR检测、人工接种粗缩病毒抗病性鉴定,获得了抗粗缩病的转基因株系,以期望为抗粗缩病新品种的选育提供参考。主要研究结果如下:1.玉米粗缩病毒基因RNA干扰表达载体的构建。在GenBank数据库搜索玉米粗缩病毒MRDV序列与水稻黑条矮缩病毒RBSDV序列并进行序列同源性比对,选取玉米粗缩病毒基因的一段保守序列做为干扰序列并进行人工合成,通过酶切连接转化,以正反向插入中间载体NPPLT,形成了含有内含子的反向重复序列结构,再经酶切连接转化,插入到具有Cre/loxP重组系统的表达载体PNCXB中,构建成玉米粗缩病毒基因RNA干扰表达载体PNCXB-848。2.农杆菌介导转基因体系的建立。以玉米材料HiII大小为1.2-1.8mm的幼胚为受体材料,在OD600值为0.5,侵染时间为10分钟条件下,用农杆菌LBA4404侵染玉米幼胚,经共培养、静息培养、愈伤组织诱导、愈伤组织低压筛选、高压筛选,获得112株再生苗,建立了稳定的农杆菌介导玉米转化体系。3.再生植株除草剂表型筛选与PCR鉴定体系的建立。为了确定再生植株除草剂(PPT)表型筛选的合适浓度,分别设立了30mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L不同浓度处理,五天后观察叶片表型,结果表明,200 mg/L除草剂(PPT)浓度为表型抗性筛选的最低易观察浓度。对T1代247株玉米进行除草剂表型筛选,92株表现为阳性,概率为37.2%。对T2代25个穗行进行除草剂表型筛选,11个穗行的除草剂抗性概率较高,均在40%以上,最高达到100%。结合再生植株标记基因(Bar)、目的基因PCR检测,成功建立了转基因植株的鉴定体系。4.转基因穗行的抗病性鉴定。以非转基因穗行W670、感病自交系Mo17、抗病自交系沈137作对照,对T2代的13个穗行,采取室内饲养灰飞虱、饲毒,在田间应用网箱集团接种灰飞虱技术进行粗缩病抗病性鉴定。感病对照Mo17发病概率为60%,非转基因穗行W670发病概率为57.1%,抗病对照沈137无明显发病症状。1 3个鉴定穗行中,3个穗行的发病概率相对较低,分别为15.8%、0&、0%,明显低于感病对照Mo17和非转基因穗行W670的发病概率,初步鉴定为转基因抗粗缩病株系,其它穗行全部或部分表现出明显粗缩病症状,建立了玉米粗缩病的鉴定体系。更多还原