“化杀灵WP1”诱导的甘蓝型油菜雄性败育花蕾中SSH文库的构建及筛选

【作者】 唐志康； 黄荣仙； 田露申； 郭世星； 蒋良材； 蒲晓斌； 牛应泽；

【机构】 四川农业大学油菜研究中心教育部作物基因资源与遗传改良重点实验室； 四川省农业科学院作物研究所；

【摘要】 <正>[目的]构建"化杀灵WP1"诱导甘蓝型油菜雄性不育花蕾中正向抑制消减（SSH）cDNA文库和反向抑制消减（SSH）cDNA文库,寻找"化杀灵WP1"诱导甘蓝型油菜雄性不育花蕾中差异表达的相关基因。[方法]本研究采用Trizol试剂分别提取"化杀灵WP1"诱导的甘蓝型油菜R121雄性不育株花蕾和雄性正常可育株花蕾中五个不同长度的总RNA,并分别将其等量混合成1（R121雄性不育）和2（R121雄性可育）。使用Clontech公司的PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit（Cat.No.637401）试剂盒,以1为实验方（tester）,2为驱动方（driver）进行正向消减杂交,获得在R121雄性不育花蕾中被激活表达的差异片段;再反向消减杂交,获得雄性不育花蕾中被抑制表达的差异片段。将获得的差异片段与pMD19-T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,于LB/Amp/gal/IPTG固体培养基上37℃培养,挑取白色单克隆于1mlLB/Amp液体培养基中,37℃,200rpm振荡培养12小时,获得正向和反向SSHcDNA文库,以nestedprimer1和nested primer2R（试剂盒内提供）为引物进行菌液PCR筛选,分别从正向文库和反向文库中挑取20个阳性克隆,上海英俊生物公司测序,测序结果与BLASTn数据库进行比对和分析。[结果]SSHcDNA文库消减效率高,质量好,单克隆率大于90%,条带分布在100bp-1000bp之间。正向消减文库20个单克隆中得到18个有效片段,NCBI数据库比对后发现在雄性不育花蕾中特异表达的有与脱氢应答结合蛋白基因、果胶甲酯酶抑制蛋白基因等同源的基因片段;反向消减文库20个单克隆中得到17个有效片段,NCBI数据库比对后发现在雄性不育花蕾中被抑制表达的有与微管蛋白基因、脂肪酶基因、泛素化酶基因、含脯氨酸和亮氨酸的蛋白基因、叶绿体基因、线粒体基因等同源的基因片段。[结论]本研究成功构建了"化杀灵WP1"诱导甘蓝型油菜雄性不育花蕾中正向抑制消减（SSH）eDNA文库和反向抑制消减（SSH）cDNA文库,为差异表达基因的分离、鉴定和功能等后续研究奠定了坚实的物质基础。更多还原