Vps4B及其显性负性突变体抑制HBV复制的研究

【作者】 李磊； 夏剑波； 王维鹏； 杨东亮； 高人焘；

【机构】 安徽省立医院感染病科； 华中科技大学附属同济医院临床免疫研究室；

【摘要】 目的:目前抗HBV的药物,由于存在较大的副作用及耐药性等问题,限制了其应用和远期疗效,寻求新型抗HBV药物具有重要意义。近年发现细胞空泡蛋白分选因子4(Vacuolar protein sortin9,VPS4)是一种包膜病毒在细胞内复制和出芽所必需的宿主因子。且有报道提示VPS4显性负性(Dominant negative,DN)突变体可能也具有抑制HBV复制的作用。为进一步明确其抗HBV的作用及其机制,我们观察了VPS4B和其突变体在体外和体内的抗HBV效应,以及其对病毒复制生活周期不同阶段的影响,为寻求新的抗HBV的分子治疗手段奠定实验基础。方法:以pXF3H为载体构建人VPS48分子真核表达克隆,在此基础上进行定点诱变构建其显性负性突变体VPS4B-K180Q。分别与HBV可复制性克隆pHBV1.3共转染人肝癌细胞系Huh-7,采用时间分辨荧光免疫分析法定量检测细胞培养上清的中HBsAg和HBeAg含量,Southern blot检测细胞内HBV核衣壳相关DNA水平,RT-PCR法半定量检测HBV相关mRNA。并采用高压尾静脉注射的方式,将VPS4及其突变体导入到HBV急性感染小鼠肝脏内,real-time PCR法测定血清病毒载量,免疫组织化学染色观察肝细胞内nBeng表达情况,明确其对体内HBV的抑制作用。结果:VPS4B分子可抑制Huh-7细胞分泌HBsAg和HBeAg,VPS4B-K180Q对前述抗原分泌的抑制作用更明显,分别为野生型的2.8倍和5.0倍,P<0.05;对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用也较强。VPS4B野生株和突变体均可有效抑制小鼠HBV病毒血症,注射后第5天HBV DNA载量分别为:6.5±0.8E6 copies/ml、5.2±1.4E5 copies/ml、8.3±1.2E7 copies/ml(对照组);P<0.05。肝组织HBcAg免疫组化染色显示VPS4B-K180Q对HBV蛋白表达的抑制作用强于野生株。结论:在体外和体内VPS4B分子及其显性负性突变体K180Q均可抑制HBV复制,且后者的抑制作用更强。其抗HBV作用可发生在复制、转录、翻译阶段上,但以转录后环节为主。更多还原