【作者】 何芳；

【导师】 周向东；

【作者基本信息】 重庆医科大学 ， 内科学， 2014， 硕士

【摘要】 目的：探讨栓链因子复合物亚基Sec3对中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）诱导的气道上皮细胞黏蛋白分泌的影响。方法：1、体外培养人气道上皮细胞16HBE，随机分为8组：A组：空白对照组；B组：AG1487（表皮生长因子受体磷酸化抑制剂）组；C组：Sec3siRNA组；D组：阴性siRNA对照组；E组：NE组；F组：NE+AG1478；G组：NE+Sec3siRNA组；H组：NE+阴性siRNA组；2、以中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）作为刺激因素，构建黏液高分泌模型，分别采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、逆转录-聚合酶链反应（rt-PCR）分析受刺激组和对照组MUC5AC的转录和分泌水平，Western印迹法分析磷酸化表皮生长因子受体（p-EGFR）水平。3、以AG1487作为抑制，阻遏表皮生长因子受体信号通路，采用Western-blot法检测抑制组和对照组磷酸化EGFR水平，验证AG1487的抑制效应，并分析比较抑制组和对照组黏蛋白的表达情况。4、用Sec3-siRNA-pLKO.1lentiviral载体转染Sec3siRNA，以抑制Sec3功能，采用Western-blot法检测转染组和对照组Sec3水平，确认其转染成功后，分析转染组和对照组在中性粒细胞弹性蛋白酶刺激下，MUC5AC转录和胞外分泌水平的变化。结果：1、中性粒细胞弹性蛋白酶刺激下，MUC5AC的转录（E组：0.75±0.05）和胞外分泌水平(E组：0.80±0.09)显著提高，（p﹤0.01），相应，表皮生长因子受体的磷酸化水平（E组：0.87±0.12）也明显增加（p﹤0.01）。2、加入表皮生长因子受体磷酸化抑制剂后，p-EGFR水平下降（F组：0.13±0.06）（p﹤0.01），中性粒细胞弹性蛋白酶的刺激作用受到抑制，MUC5AC转录水平(F组：0.38±0.06)较未受抑制组(E组：0.75±0.05)显著下降（p﹤0.01），分泌水平（F组：0.32±0.08）也随之降低（p﹤0.01）。3、转染Sec3siRNA后，随着Sec3蛋白表达的下降（G组：0.11±0.06）（p﹤0.01），MUC5AC的胞外分泌水平（G组：0.36±0.09）也显著降低（p﹤0.01），但其转录水平（G组：0.72±0.04）并未受到影响（p﹥0.05）。结论：在NE诱导的人气道上皮细胞黏液高分泌过程中，EGFR是介导MUC5AC合成的主要信号通路，栓链因子复合物亚基Sec3则对黏蛋白出胞分泌有重要的介导作用。更多还原

【Abstract】 Objective：To explore the effects of exocyst complex subunit Sec3on secretion ofmucin（MUC）5AC induced by neutrophil elastase(NE) in human airwayepithelial cells.Methods：1、The16HBE airway epithelial cells were cultured and divided into8groups:GroupA: negative control group；GroupB: epidermal growth factor receptor（EGFR） phosphorylatedinhibitor (AG1487) group；GroupC: Sec3siRNA group；GroupD: negative siRNA control group；GroupE: NE stimulation group；GroupF: epidermal growth factor receptor（EGFR） phosphorylatedinhibitor (AG1487) group treated with NE；GroupG: Sec3siRNA group treated with NE； GroupH: negative siRNA control group treated with NE.2、Choose the neutrophil elastase（NE） as stimulating factor toestablish the hypersecretion model. The level of MUC5AC protein insupernatant, MUC5AC mRNA in culture cells and phosphorylatedepidermal growth factor receptor (p-EGFR) were detected withenzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), reversetranscription-polymerase chain reaction (RT-PCT) and Western-blotrespectively.3、Using EGFR phosphorylated inhibitor（AG1487） block the EGFRsignal pathway，detect the level of p-EGFR in AG1487group and controlgroup with Western-blot，and analyse the level of expression of MUC5ACin the two groups.4、Transfecting of the Sec3siRNA to inhibit the function of Sec3，detect the level of Sec3in Sec3group and control group withWestern-blot，confirm the transfection succeed，then analyse the level ofexpression and exocytosis of MUC5AC in the two groups.Results：1、The relative contents of MUC5AC protein in supernatan（tgroup E：0.80±0.09），MUC5AC mRNA（group E：0.75±0.05）and pEGFR（groupE：0.87±0.12）in culture cells in the NE-stimulated group, all hadsignificantly risen when compared with normal control group(p﹤0.01).2、After the addition of EGFR phosphorylated inhibitor，the effect ofNE were suppressed，the level of transcription (group F：0.38±0.06) and secretion （group F：0.32±0.08） of MUC5AC had significantly decreasedwhen compared with control group(p﹤0.01).3、The siRNA of Exocyst complex subunit Sec3only inhibited thesecretion of MUC5AC （group G：0.36±0.09）(p﹤0.01), and didn’teffect the transcription process（group G：0.72±0.04）(p﹥0.05).Conclusion：In the process of MUC5AC hypersecretion induced by neutrophilelastase in human airway epithelial cells, EGFR is the main signal pathwayto mediate the synthesis of MUC5AC，and exocyst complex subunit Sec3play a critical role for mucin exocytosis.更多还原