【作者】 李兵；

【导师】 庄国强；

【作者基本信息】 山东大学 ， 微生物学， 2005， 硕士

【摘要】 纤维素是年产量巨大的可再生性资源,地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中,纤维素占了近一半。利用这一年产量巨大的可再生性资源将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。但目前制约纤维素资源利用的主要障碍是纤维素酶的酶解效率太低。一方面是由于纤维素本身的结构的问题,另一方面,纤维素酶对于纤维素的结合,催化等方面的理论研究还有待深入。 毕赤酵母是目前最成功的外源蛋白表达系统之一,至今已有300多种外源蛋白在该表达系统中成功表达。但目前国内外没有报道在毕赤氏酵母表达系统中成功表达纤维素内切葡聚糖酶EGⅢ。 本论文通过对纤维素内切酶EGⅢ基因的克隆,构建了重组质粒pPIC9K-EGⅢ,并对重组蛋白在Pichia pastoris中的表达情况进行了研究,建立了纤维素内切葡聚糖酶EGⅢ在Pichia pastoris中的表达系统;在此基础上通过对含有不同EGⅢ基因拷贝数的工程菌株的生长和表达情况进行了研究,试图探讨插入基因剂量的不同对纤维素内切葡聚糖酶EGⅢ在Pichia pastoris中表达的影响。在酶动力学方面,我们根据蛋白质在固体表面吸附、钝化理论建立了纤维素酶动力学模型,并试图通过EGⅢ的反应动力学对该模型进行拟合,确定模型中各项参数的EGⅢ数值解。 本研究工作为今后的纤维素酶酶学研究提供了相应的实验基础;并为下一步开展纤维素内切酶EGⅢ的定向进化工作提供了实验指导;也为进一步建立多种纤维素酶在酵母中的共表达研究提供了相应的理论基础。更多还原

【Abstract】 Cellulose is a kind of reproducible resource of great output, it takes about a half of the hundred million biomaterial making by photosynthesis. It is of great importance to transfer these resource to energy ,food, and so on. The main obstacle of using cellulose resource is the low celiulase activity. On one hand , the it is because the structure of the celiulase itself, on the other hand, we need deeper research of celiulase binding, cacatalyse activity.In this study, first, we express the Trichoderma reesei ’s Endocellulase in Pichia pastoris. After this, we contrast the expression ability of the recombinant which has the different gene copy of EGⅢ.The structure gene of EGⅢ were obtained by PCR. This gene was inserted between the pPIC9K’s AOX1 promoter and the TT point. Then, the reform plasmid pPIC9K-EGⅢ was transferred to P. pastoris GS115 yeast. And was expressed by this yeast. All the recombinant yeast strains secreted EGⅢ protein by the abduction of methanol.Second, we launch a study of the Kinetics of cellulose hydrolyze by EGⅢ. In this section, we form a Kinetics model based on the Theory of Protein Adsoped on the solid surface. Then, we try to use the experiment data to calculate out the parameter in this Kinetics model.更多还原