【作者】 郭蓉；

【导师】 张金文； 刘玲；

【作者基本信息】 甘肃农业大学 ， 作物遗传育种， 2005， 硕士

【摘要】 轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体,尤其在发展中国家,每年受轮状病毒危害的婴幼儿数量非常巨大。目前,对轮状病毒感染最有效的预防和控制措施,仍是注射疫苗。VP4 和VP7 是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原,VP6 是主要的病毒蛋白,能诱导产生IgG 抗体和IgA 抗体,与保护性免疫有关。这三个基因片段是发展基因工程疫苗的首选。　本试验以胡萝卜下胚轴为受体材料,通过农杆菌介导法将轮状病毒片段基因VP4、VP6 和VP7 转入胡萝卜中,对胡萝卜转化体系中的一些关键性的步骤进行了条件优化,如:下胚轴的浸染时间、共培养时间、Kan 敏感试验、Cab 和Cef 的对比试验等对转化的影响,建立了高效的胡萝卜遗传转化体系。主要研究结果如下:　1.用农杆菌浸染7～9　d 苗龄的胡萝卜下胚轴约15　min,共培养2～3　d 后,转入B5附加75　mg/L　Kan+500　mg/L　Cab 的愈伤诱导培养基上,待形成抗性愈伤后,继代到B5附加100　mg/L　Kan　+　500　mg/L　Cab 的抗性芽诱导培养基上,当苗长至2～3　cm 时,转入B5附加　0.1　mg/L　IBA　+　75　mg/L　Kan　+　300　mg/L　Cef 的生根培养基上,2～3 周后可得到Kan 抗性苗。　2.　经过几次Kan 的筛选,得到Kan 抗性植株408 棵,并对其进行PCR 检测。其中156 棵转VP6 基因的Kan 抗性植株,有58 棵为PCR 阳性,阳性率达到37.2　% ;172棵转VP7 基因的Kan 抗性植株,有84 棵为PCR 阳性,阳性率达到48.8　%;80 棵转VP4 基因的Kan 抗性植株,有31 棵为PCR 阳性,阳性率达到38.8　%。　3. 用塑料布覆盖并逐渐打开通风口方法炼苗,抗性植株长势好,抗性强,成活率提高了35　%。低温春化,试验大棚和陆地相比,死亡率降低了49.5　%。　4.　对T0代转VP6 和VP7 基因的植株经RT-PCR 检测初步证明了VP6、VP7　基因的转录。对T1代转VP6和VP7基因的植株分别进行了PCR、PCR-Southern　blot和Southern　blot 检测,证明目的基因已经整合到胡萝卜基因组上。　5. 对7 个株系T1代植株的PCR 分析,得出其中两株系接近1:1,另两株系为1:3。更多还原

【Abstract】 Rotavirus　(RV)　infection　is　a　major　cause　of　dehydrating　diarrhea　in　children　all　over　the　world,　especially　in　developing　country.　VP7　and　VP4　are　major　outer　capsid　protein　and　they　are　　primary　candidates　for　inclusion　in　a　subunit　or　recombinant.　Vp6　is　main　virus　protein,　can　induce　body　to　produce　antibody.　So　introducing　VP7、VP4　and　VP6　genes　into　carrot　to　develop　edible　plant　vaccine　of　rotaviruses　would　change　the　traditional　means　of　production　of　vaccines　and　the　cost　of　vaccine　production　would　be　reduced　greatly.　It　is　provided　with　commercial　meaning　and　applicative　prospect.　In　this　study　,　hypocotyls　were　used　as　the　explant,vp4、vp6　and　vp7　genes　were　introduced　into　carrot　by　Agrobacterium　tumefaciens　LBA4404,　and　high-efficient　genetic　transformation　system　of　carrot　were　established,such　as:　Infected　times,　co-cultural　condition,　Kan　sensitive　experiments,　Cab　and　Cef　contrastive　experiments.　Thee　results　indicated　that:　1.　7d　seedling,　2　d　of　co-cultivation　and　15　min　of　infection　of　system.　Media　of　resistant　callus:　B5　+　0.1　mg/L　2,　4-D　+　0.2　mg/L　KT　+　75　mg/L　Kan　+　500　mg/L　Cab.　Media　of　resistant　shoots:B5　+　100　mg/L　Kan　+　500　mg/L　Cab.　Media　of　resistant　root:　B5　+　0.1　mg/L　IBA　+　75　mg/L　Kan　+　300　mg/L　Cef.　2. Hundreds　of　regenerated　Kan-resistant　carrot　plantlets　were　gained　and　analyzed　by　PCR,58　of　156　plantlets　were　confirmed　that　the　VP6　gene　had　been　inserted　into　plant　genome;84　of　172　plantlets　were　confirmed　that　the　VP7　gene　had　been　inserted　into　plant　genome;31　of　80　plantlets　were　confirmed　that　the　VP4　gene　had　been　inserted　into　plant　genome.　3.　Resistant　plants　were　covered　with　plastic　velamen　and　gradually　opened　the　plastic　velamen.　The　resistance　of　plants　grows　well　and　increases.　The　survival　rate　enhanced　35　%.Compare　with　land,　death　rate　in　the　greenhouse　reduced　49.5　%　in　low　temperature　jarovization.　4.　RT-PCR　detection　showed　primarily　the　transcription　of　VP6　and　VP7.T1　plantlets　with　VP6,VP7　genes　were　further　confirmed　by　PCR,PCR-　Southern　and　Southern　blot　that　the　target　gene　had　been　inserted　into　the　carrot　genome.　5. PCR　analysis　for　7　transgenic　plants　in　T1　generation　showed　two　of　them　closed　to　1:1.Other　two　plants　closed　to　1:3.更多还原