【作者】 王永久；

【导师】 崔瑞耀；

【作者基本信息】 青岛大学 ， 病理学与病理生理学， 2002， 硕士

【摘要】 催产素（oxytocin，OT），一种神经肽，在外周组织和中枢神经系统内（CNS）都发挥着重要的生理作用。在外周，OT主要参与分娩、泌乳和水钠代谢的调节；在脑内，OT与母性行为和生殖行为、学习记忆、镇痛等生理功能有关。有研究发现，早老性痴呆症病人，其海马内OT浓度的增加非常显著。近来的研究还发现，OT可抑制阿片类药物的耐受和依赖。这提示OT在脑内参与了很多生理和病理生理过程。 在外周组织，OT主要通过与其受体（oxytocin receptor,OTR）结合从而启动多种信号转导途径而发挥作用。例如，OT与子宫平滑肌细胞上的OTR结合后，通过Gq-PLC信号转导途径使细胞内Ca²⁺浓度升高而导致平滑肌收缩。但CNS内OT-OTR的作用机制仍不清楚，因此很有必要对CNS内OTR的生理作用及其信号转导机制进行研究，这有利于揭示CNS内OT的多种生理功能；阐明OTR在一些疾病如痴呆症，药物成瘾的发病机制中起到的作 中文摘要 用。 1992年，Kimura首先从人子宫肌层的 cDNA文库中利用表达性筛选方 法克隆得到了＊＊R的C DNDNA，全长约4．Ikb，其中编码区为11 67 hp，编码38吕 个氨基酸。随后，数种哺乳动物的OTR。DNA基因相继被克隆和解析，其组 织来源均为于宫和其它外周组织、细胞。虽然，目前的克隆结果表明只有一 种OTR；但有研究提示在中枢神经系统内可能存在OTR的另外亚型，OT与 其结合后可能发挥与外周不同的作用。从脑中克隆OTR cDNA全长的研究 从未见报道，1995年，Adan R．A．H．利用RT平CR从大鼠脑内克隆了第五跨 腆和第六跨膜域之间氨基酸的编码序列，约290hp，与于宫的编码序列完全 一样。但山于在OTR基因中，这部分序列位于第三个内含子以前，因此并 不能挑除剪按内含子时导致的异变体，从而产生0＊R的亚型。所以，克隆 脑中 OTR CDNA编码区全长是非常必要的。 我们采用RT－p＊R的方法从大鼠外周和中枢神经组织中同时克隆0＊R 的cDNA编码区全长，然后对这两个序列进行比较，以探讨脑内OTR的 。DNA编码区是否与外周组织不同。而获得OTR。DNA为从分子水平研究脑 内OTR的结构、功能和临床意义奠定了基础。 关于OTR在大肠杆菌内的表达，国内外尚未见报道。在克隆得到OTR 的CDNA后，我们尝试在大肠杆菌中进行OTR全长和不同片段的表达，以 获得大量的重组OTR蛋白。我们利用pET毛8－a载体构建了OTR全长与His tag融合蛋白原核表达载体：pET毛8＊－OTR；利用pGEX叶TI载体构建了 OTR不同结构域与 GST（Glutathione S－Transferase，谷眺甘肽七转移酶）的融 合蛋白表达载体：pGEX4T上－OTRN 40，pGEX＊T上－OT洲40 和 pGEX斗ToDTRC55。然后在大肠杆菌表达株 BLZI内进行了这些重组质粒 在 的诱导表达研究。 I 2 中文摘典 CHO（Chin hamster ovary）细胞，中国仓鼠卵巢细胞，足目前F)【究蛋自 质冥核表达和信号转导等应用最多的细胞之一。因此，本工作的另一个目的 就是利用细胞培养和真核转染技术，建立一个稳定表达OTR的真核细胞株， 即 CHO．OTR，CHO－OTR是体外研究OTR信号转导杉制的良好模型。 此外，我们还分别利用核酸疫苗技术和常规免疫技术制备了OTR的抗 血清。免疫印迹证明，利用 pCDNA3．IOTR和 OTR－GST融合蛋白免疫 BALB儿 ，J’鼠得到的抗血清均与子宫中OTR发生免授反应，其中 pCDNA3．IOTR的抗体特异性股强。 本工作的主要结果如下：互 1．成功地从分yk后大鼠的脑和子宫组织中，利用 RTICR (方法克隆得到 0＊R的C＊＊A编码区全序列：应用0＊A序列比较软件＊陀川屯n对脑和 子宫中的OTR的。DNA编码区全序列进行比较，发现来源于脑和子宫组 织的 OTR CDNA编码区序列是完全一致的，且大小均为门 67hp。 2．将OTR CDNA编码区全长亚克隆至pET－28·口载体、将OTR CDNA编 码区 5’端420hp、5’9 120 hp和3’端 168hp 的片段分别亚克隆至pGEX－4T－3 载体，然后将这些重组质粒在大肠杆菌 BLZI内进行表达，发现只有 5’端 120 hp，即编码 OTR氨基端胞外域的基因片段能够在大肠杆菌内高效表 达。 3．优化诱导表达的条件，得到大量水溶性的OTR氨基端胞外域与GST的 触合蛋白(更多还原

【Abstract】 Oxytocin(OT) , a neurohypophyseal nonpeptide ,has both peripheral and central action .Peripherally, as a hormone , OT plays an important role involved in parturition .lactation and regulation of water or sodium . In the brain , OT has relationship with mating and maternal behaviors , study and memory , and relieving pain .Some study found that the concentration of OT in the hippocampus of elderly dementia patients increased. Furthermore , recent study demonstrated OT may inhibit the tolerance and dependence of morphine drugs. All these show that OT plays an important role both in physiological and pathophysiological function in the brain.In peripheral tissue ,OT binds to OTR and then activates multiple signal pathways to exerts its functions .For example ,in uterine smooth muscle cell ,OTR may increases the Ca2+ concentration inside the cell via activation Gq-PLC pathway, then uterine smooth muscle contracts. But the signal transduction mechanism and function of OTR in the brain is unknown .It is very necessary to study the structure of OTR and its signal pathway in the brain .All these study may be helpful to explore the function of OTR in the brain ,also helpful to elucidate the pathogenesis of some disease concerning with OTR.In 1992 , Kimura first cloned the OTR cDNA from human myometrium cDNA library by expression cloning .The full length of OTR cDNA was4.1kb,and the encoding region of the cDNA was 1167 bp. So the cDNA encoded 388-amino-acid protein. Subsequently, the OTR cDNA of other mammalian animals was also cloned .All these clone were from peripheral tissue and cell lines , and demonstrated these clone encoded one type OTR .Some studies show that there is another type OTRin CNS, and OT may exerts different functions like peripheral tissue. The cloning of full length OTR cDNA in the brain was not reported. In 1995, Adan R.A.H. cloned the 290bp encoded the fifth transmembrane domain between sixth transmembrane domain from rat brain by RT-PCR. The DNA sequence of this segment was the same to the uterine .But the gene of this domain is ahead of the third intron in the OTR gene ,so may exist the OTR subtype produced by splicing the third intron. Therefore ,it is necessary to clone the full length of the brain OTR cDNA.We cloned the full length OTR cDNA. both of the brain and uterus by RT-PCR, then we compare their DNA sequence to find any difference .The OTR cDNA is very important to study OTR at molecular level. So the OTR cDNA we have cloned is the base to study the structure , function and its clinical significance.There is no report of OTR gene expression in E.coli system yet. Because we want to get a lot of OTR protein by genetic engineering .So we attempted to express OTR in E.coli BL21 after cloning OTR cDNA. In this study we constructed these prokaryotic expression vectors: pET-28- a -OTR to express the fusion protein of full length OTR and His tag ,pGEX-4T-3-OTRN140,pGEX-4T-3-OTRN40 and pGEX-4T-3-OTRC55 to express the fusion protein of different OTR domain and GST. Then we expressed these cloning plasmid in E.coli BL21 .CHO cell is widely used in the study of protein expression in eurcaryotic cell and signal transduction .So, another aim is to establish a cell line expressing OTR by cell culture and transfection technique .In this study ,we established CHO-OTR cell which expression OTR. Furthermore , we demonstrated OTR expression by western blot.In addition ,we produced OTR antiserum by routine immunization and DNA vaccine technique . In this study ,we immunized BALB/c mouse by pcDNA3.1-OTR and fusion protein GST-OTRN40 . The specificity of immunoreactivity is verified by the western blot analysis . The main results of our research are as follows:1. The rat OTR cDNA full length was successfully cloned by RT-PCR from rat brain and uterus. The full encoding sequence of OTR cDNA both from the brain and from the uterus is identical. Their size is 1167bp.2. We utilized pET-28-a vector to carry the full length of encodin更多还原