核因子-κB反义基因抑制肾系膜细胞炎性效应的研究

【作者】 丁桂霞；

【导师】 陈荣华；

【作者基本信息】 南京医科大学 ， 儿科学小儿肾脏病， 2001， 硕士

【摘要】 肾小球固有细胞及局部浸润的炎症细胞所分泌的炎症因子共同决定了肾小球肾炎的发生、发展和转归。研究证实转录因子NF-κB在肾小球系膜细胞活化、增殖和炎症因子的产生中处于中心地位。因此，如何特异性阻断NF-κB活化以减轻肾脏炎性病变已成为人们研究的热点。反义技术的兴起，为特异性阻断靶基因表达奠定了基础，提示有可能应用NF-κB反义基因特异性阻断NF-κB的活化，从而降低炎性因子的分泌，减轻肾组织损伤。本研究应用反义技术、体外细胞培养技术及分子生物学技术（核酸酶保护法、Western印迹和RT-PCR），对以下三个方面的内容进行了研究，为利用NF-κB反义基因类药物治疗肾小球炎性病变提供理论依据和技术基础。 第一、观察阳离子脂质体对人肾小球系膜细胞摄取反义寡核苷酸 （ODN）的影响，并确定反义ODN转染系膜细胞的最佳转染效 率，为反义ODN有效载体的选择提供理论依据。 第二、观察NF-κB p65亚基反义ODN对人肾小球系膜细胞炎症介质 表达的影响，为利用NF-κB反义ODN类药物治疗肾小球炎性 病变奠定基础。 第三、观察NF-κB p65亚基反义ODN对人肾小球系膜细胞p65 mRNA及蛋白表达的影响，探讨p65反义ODN的作用机制。 研究发现：1.反义ODN转染系膜细胞后可分布于胞浆及胞核内。脂质体介导的反义ODN大部分进入胞核，而无脂质体介导的反义ODN主要分布于胞浆。2.无脂质体介导组转染系膜细胞6h后转染效率为11.37％，36h达到高峰（5.83％）。脂质体介导组转染6h摄取率为16.55％，18h转染效率已达到高峰（95.85％），24h仍维持高峰平台期（95.64％）。反义ODN对系膜细胞的转染效率呈时间依赖性。3．正常培养状态下，系膜细胞组成型表达TNF-α、IL-1β、IL-8和TGF-β1 mRNA，而不表达IL- 南京医科大学硕士学位论文la和 MCPI mRNA。LPS刺激后上述细胞因子表达显著上调。4．p65反义ODN呈剂量依赖性抑制LPS诱导的细胞因子TNFa，IL叶，IL1队MCPI和 IL七 mRNA表达，对TGF－pl mRNA表达无影响。p65正义及错配ODN不能抑制LPS诱导的细胞因子mRNA表达。5．p65反义ODN呈剂量依赖性阻断体外培养的系膜细胞 p65 mRNA及蛋白表达，正义及错配ODN对p65的表达没有阻断作用。 以上实验结果提示：1．脂质体使反义ODN在细胞内的分布发生改变，经脂质体介导后反义ODN更易进入胞核发挥作用。2．脂质体介导组系膜细胞的摄取效率高于无脂质体介导组，并且前者的摄取高峰较后者提前出现。3．NF－h p65亚基反义ODN可明显抑制LPS诱导的肾小球系膜细胞炎性细胞因子的mRNA表达，p65反义ODN有可能应用于肾脏病变的实验性治疗。4．p65反义ODN阻断系膜细胞p65 mRNA及蛋白表达，从而下调炎性细胞因子mRNA表达，提示NF俯作为一种反式作用因子，在基因转录水平对靶基因的表达进行调控。更多还原

【Abstract】