毕赤氏酵母/hGM-CSF工程菌的构建及表达分析

【作者】 杨国峰；

【导师】 周鹏；

【作者基本信息】 华南热带农业大学 ， 作物遗传育种， 2001， 硕士

【摘要】 本研究利用初步改造的hGM-CSF基因构建了PGAPZα-A/hGM-CSF重组分泌型表达载体，将其转入毕赤氏酵母SMD1168菌株和GS115菌株，得到了整合有hGM-CSF基因的工程菌。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选得到了1号、2号和6号三个表达较好的工程菌，根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质相对分子量的方法测得1号、2号和6号电泳样品中主带蛋白质的相对分子量分别为的15.135kD、14.791kD和14.454kD，与文献报道的hGM-CSF的相对分子量（14.4kD）的差在±10％以内，说明主带蛋白质可能是hGM-CSF。利用Folin-酚试剂法测得1号、2号和6号工程菌发酵液上清中的蛋白质总浓度分别为46.5μg/mL、54.7μg/mL和46.5μg/mL，用薄层扫描仪分析染色后的聚丙烯酰胺凝胶得到了1号、2号和6号样品中主带蛋白质在其蛋白质总量中所占的比例，分别为47.002％、45.731％和51.166％，计算得到了1号、2号和6号工程菌中主带蛋白质的表达量分别为1.093μg/mL、1.251μg/mL和1.190μg/mL。TF-1依赖细胞株/MTT比色法检测活性的结果表明1号、2号和6号工程菌分泌表达的蛋白质具有天然hGM-CSF的生物活性，活性单位分别为1.14×10~4U/mL、1.11×10~4U/mL和1.23×10~4U/mL，比活性分别为1.043×10~7U/mg、0.887×10~7U/mg和1.034×10~7U/mg，与文献报道的hGM-CSF的比活性（0.8～1.1×10~7U/mg）相符，初步确定主带蛋白质是hGM-CSF。本研究初步验证了毕赤氏酵母表达hGM-CSF的可行性，在hGM-CSF的商业化生产和临床应用方面具有重要的理论和应用价值。更多还原

【Abstract】 Construction and Assay of recombinant Pichia pastoris strainscontaining hGM-CSF geneYang GuoFeng(South China University of Tropical Agriculture, Haikou, Hainan 571101)Abstract The gene encoding human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(hGM-CSF) was cloned to a downstream site of promoter GAP of pGAPZ a ?A vector. The recombinant expression vector was transfected into SMDI 168 strain(his4, pep4) and GS 115 strain(his4) of Pichia pastoris. SDS-PAGE analysis of secretory proteins indicated that three recombinant strains( 1 ~? 2#, 6#) were able to express 14.454-15.l35kD proteins at high level whose relative molecular mass are corresponding to hGM-CSF. The supernatant of recombinant yeast cultures was assayed for hGM-CSF activity using MTT method. The results showed that these proteins expressed by recombinant strains had the same activity as natural hGMCSF and the specific activity were 1.043 X 107U/mg(1#),O.887 X l07U/mg(2~) and 1.034>( 1 07U/mg(6#). These data demonstrated the feasibility of production of recombinant hGM-CSF in Pichia pastoris initially.更多还原