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双酶切和同源重组方法构建pMIR-reporter载体的比较  
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【英文篇名】 Comparison of the construction of a pMIR-reporter vector using conventional double enzyme restriction and recombination
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【作者】 马凯; 胡红霞; 于婧; 周丹; 孙艳; 马磊; 沈波;
【英文作者】 MA Kai; HU Hong xia; YU Jing; ZHOU Dan; SUN Yan; MA Lei; SHEN Bo; Department of Pathogen Biology; Nan Jing Medical University;
【作者单位】 南京医科大学病原生物学系;
【文献出处】 中国病原生物学杂志 , Journal of Pathogen Biology, 编辑部邮箱 2015年 06期  
期刊荣誉:中文核心期刊要目总览  ASPT来源刊  CJFD收录刊
【中文关键词】 载体; 酶切; 连接; 同源重组;
【英文关键词】 Vector; restriction enzymes; ligation; recombination;
【摘要】 目的以pMIR-reporter为载体骨架,通过双酶切方法和同源重组方法构建载体,比较两种不同载体构建方法的优缺点。方法双酶切方法使用HindⅢ和MluⅠ两种限制性内切酶分别酶切pMIR-reporter和经T-A克隆后靶基因PCR片段,形成带有相同粘性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌感受态细胞,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序。同源重组方法利用同源重组原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经HindⅢ酶切pMIR-reporter线性载体重组连接,连接产物转化入大肠埃希菌感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果从载体构建耗时、总步骤数和阳性率三方面进行比较,双酶切载体构建方法需要26个独立试验,试验净耗时96h,阳性率为95%;同源重组法需要14个独立试验,试验净耗时33h,阳性率为70%。结论双酶切载体构建方法步骤繁琐。同源重组法步骤相对简单,可以高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。
【英文摘要】 Objective In molecular biology experiments,expression vectors are usually constructed in order to stably express foreign genes in cells.In this study,two different methodologies were used to generate pMIR-reporter vectors.Methods In conventional double enzyme restriction,PCR fragments of the target gene were first inserted into a T-A cloning vector.The restriction enzymes HindⅢ and MluⅠ were then used to generate sticky ends on a linearized pMIRreporter vector and PCR fragments of a target gene from a T-A c...
【更新日期】 2015-09-08
【分类号】 Q782
【正文快照】 *基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法[1-2]。通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法,这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理,用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段,与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有

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