棉铃虫中肠钙粘蛋白基因的克隆、表达及Cry1A结合区定位

【摘要】 钙粘蛋白是动物糖蛋白的一个家族,在细胞与细胞间粘附过程中起着重要作用.最近的研究表明,昆虫中肠膜上的钙粘蛋白是Bt毒素Cry1A的受体,它的变异与昆虫对Bt产生抗性有关.通过简并引物PCR扩增结合RACE技术克隆了编码棉铃虫中肠钙粘蛋白的完整cDNA序列,该cDNA全长5581bp(已经在GenBank中登记,序列号为AF519180),编码1730个氨基酸,预测分子量和等电点分别为195.39kD和4.23.推导的氨基酸序列包括一个信号肽、一个前蛋白区、11个钙粘蛋白重复、一个靠近细胞膜的区域、一个跨膜区和细胞质内部分.序列比较结果表明。推导的氨基酸序列与烟蚜夜蛾钙粘蛋白氨基酸序列同源性最高,达到84.2%;与家蚕、烟草天蛾和棉红铃虫的钙粘蛋白氨基酸序列同源性分别为60.3%,57.5%和51.0%.用PCR方法获得了不同大小的钙粘蛋白基因片段,缺失体表达和配体结合试验表明,重组钙粘蛋白能与Cry1Ac发生结合,结合区位于第1217-1461位的244个氨基酸组成的肽链上.半定量RT-PCR结果表明,钙粘蛋白主要在棉铃虫中肠表达,在前肠和后肠表达量很低,在肠道以外的组织中不表达.棉铃虫对Cry1Ac产生抗性后,钙粘蛋白的表达量明显降低.证实了棉铃虫中肠钙粘蛋白是Bt毒素Cry1Ac的受体,并且将钙粘蛋白与Cry1Ac结合的区域定位到244个氨基酸组成的肽链上,推测?更多还原